我国糖尿病患者人数众多，目前已超过1亿人，糖尿病的主要危害在于慢性并发症。高血糖是糖尿病的一个重要特征，是引起糖尿病几乎所有并发症（如大血管病变、微血管病变、神经病变等）的最直接因素。高血糖引起糖尿病血管病变的机制是多方面的，包括细胞内活性氧（ROS）的产生^[1-2]、炎性细胞因子的产生增多^[3]、线粒体损伤^[4]等。

硫化氢（H₂S）是近年来研究较多的内源性气体信号分子，生理浓度H₂S对多种细胞有保护作用。体内许多组织细胞，如心肌细胞、内皮细胞等能产生内源性H₂S。2型糖尿病患者及链脲霉素诱导的糖尿病大鼠，其血浆H₂S水平明显降低^[5]。

瘦素是一种由脂肪细胞和其他细胞释放的相对分子质量为16 000的多肽，参与食欲与能量代谢的调节^[6]，在维持能量代谢内环境的作用日益受到重视^[7]，瘦素是通过瘦素受体而产生生理与病理生理作用的。有研究证实外源性H₂S能通过抑制瘦素/瘦素受体通路对抗高糖引起的心肌细胞损伤^[8]。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）可分泌瘦素^[9]，而高瘦素血症与血管病变有关，其作用机制与胰岛素抵抗不同^[10]。因此我们推测，外源性H₂S在高糖引起的血管内皮细胞损伤中亦可能起到保护作用，且可能是通过抑制瘦素/瘦素受体通路实现的。

本文应用40 mmol/L葡萄糖处理HUVECs 24 h建立高糖（high glucose, HG）损伤内皮细胞模型，探讨：外源性H₂S能否抑制高糖引起的HUVECs损伤；H₂S的保护作用是否通过调控瘦素/瘦素受体通路实现。

人脐静脉内皮细胞（广州吉妮欧）；瘦素抗体、瘦素受体抗体、GAPDH抗体（Proteintech）；瘦素拮抗剂（leptin antagonist, LA）（Prospec）；硫氢化钠、Hoechst 33258、DCFH-DA、罗丹明123（Sigma）；细胞计数试剂盒-8（Cell Counter Kit-8，CCK-8）（Dojindo）；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（Hyclone, Gibco）。

HUVECs培养于含有10% FBS的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO₂条件下的培养箱中培养。

实验分为6组：（1）正常对照组（control）：无血清的DMEM培养基（含5.5 mmol/L葡萄糖）处理HUVECs 24 h；（2）HG损伤组：40 mmol/L葡萄糖作用于HUVECs 24 h；（3）NaHS预处理+HG损伤组：400μmol/L NaHS作用于HUVECs 30min之后撤去，PBS冲洗2次，接着用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；（4）LA预处理+HG损伤组：50 ng/mL LA作用于HUVECs 1 h之后撤去，PBS洗2次，接着用40 mmol/L葡萄糖作用24 h；（5）NaHS处理组：400μmol/L NaHS作用于HUVECs 30 min之后撤去，PBS洗2次，接着用无血清DMEM培养基培养24 h；（6）LA处理组：50 ng/mL LA作用于HUVECs 1 h之后撤去，PBS洗2次，接着用无血清DMEM培养基培养24 h。

将HUVECs接种于96孔培养板当中，每组5个复孔。当细胞生长到占培养孔面积70%~80%时，按分组进行处理后，于每孔中加入10μL CCK-8、90μL不含血清的DMEM，于37℃培养箱孵育2 h，用酶标仪记录450 nm波长处各孔的吸光度D值。取5孔D值的平均数，按以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=处理组D/对照组D×100，实验重复3次进行统计分析。

将HUVECs接种于直径为35 mm的培养皿内，当细胞生长到占培养皿面积70%~80%时，按分组进行处理后，用预冷的PBS洗3次，加入细胞裂解液（70μL），于4℃静置30 min，后12 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液（即蛋白提取物），采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。总蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶分离后，转移至PVDF膜上。用5%的脱脂奶粉（TBST配置）室温封闭1.5 h，然后分别加入特异性的一抗，即抗瘦素抗体（1：1000）、抗瘦素受体抗体（1：1000）、GAPDH（1：10 000），4℃孵育过夜，第2天早上TBST漂洗3次，每次5 min，随后与耦联辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1：5000）室温孵育1 h。为了观察总蛋白的量，用GAPDH作为内参。PVDF膜经TBST漂洗3次，每次5 min，用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X光胶片上，将胶片扫描后，用ImageJ 1.47i软件[National Institutes of Health（NIH），Bethesda，MD，USA]分析目标带的密度灰度比值比较结果。重复3次。

将HUVECs接种于24孔培养板当中，当细胞生长到占培养孔面积70%~80%时，按分组进行处理后，吸出培养基，用PBS洗3次，接着用4%多聚甲醛于4℃冰箱中固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg/L Hoechst 33258，于37℃温箱中孵育30 min。在倒置荧光显微镜下摄片，染色质均匀分布，细胞核被染成均匀蓝色的细胞认定为正常细胞，细胞核呈浓缩、碎裂的明亮蓝色的细胞认定为凋亡细胞，随机地选取视野在倒置荧光显微镜下摄片。重复3次。

将HUVECs接种于24孔培养板当中，当细胞生长到占培养孔面积的70%~80%时，按分组进行处理后，吸出培养基，用PBS洗3次，风干。在含有10μmol/L DCFHDA的无血清培养基中置于37℃温箱中孵育30 min，后用PBS漂洗3次，在倒置荧光显微镜下随机地选取5个不重复区摄片，荧光强度用ImageJ 1.410软件进行半定量分析。重复3次。

将HUVECs接种于24孔培养板当中，当细胞生长到占培养孔面积的70%~80%时，按分组进行处理后，吸出培养基，用PBS冲洗3次，风干。在含有10μg/L Rhl23的无血清培养基当中于37℃温箱孵育30 min，吸出培养基，PBS漂洗3次。在倒置荧光显微镜下随机地选取5个不重复区摄片，细胞核周围的绿色亮点即为摄取了Rhl23的线粒体。用ImageJ 1.410软件对荧光强度进行半定量分析。重复3次。

实验数据以均数±标准差表示，用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验组组间比较采用SNK-q检验，实验组与对照组比较采用Dunnett-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

如图 1所示，高糖能明显增加HUVECs的细胞毒性，导致细胞存活率下降到（56.1±3.4）%，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）。在高糖处理HUVECs之前，应用400μmol/L NaHS预处理30 min可以明显阻断高糖导致的细胞毒性，使细胞存活率增加到（67.4±3.7）%，与高糖处理组相比较，差异显著（P < 0.01）。和NaHS的抗细胞毒性作用相似，50 ng/mL LA预处理HUVECs 1 h也能显著抑制高糖引起的细胞毒性，使细胞存活率增加至（66.7±4.9）%（P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS或50 ng/mL LA处理HUVECs对细胞毒性无明显影响（P>0.05）。

图 1(Figure 1)

图 1 外源性H2S与LA抑制高糖引起的HUVECs细胞毒性 Figure 1 Exogenous H2S and leptin antagonist (LA) alleviate high-glucose (HG, 40 mmol/L)-induced cytotoxicity in HUVECs (Mean±SD, n=3). **P < 0.01 vs control group; ++ P < 0.01 vs HG-treated group.

如图 2A所示，应用40 mmol/L葡萄糖分别处理HUVECs 3、6、9、12、24 h均能明显上调瘦素的表达水平，于9 h时达到高峰。如图 2B所示，为了检测H₂S对瘦素表达的影响，用400μmol/L NaHS预处理HUVECs 30 min，再用高糖处理9 h，结果显示，能明显抑制瘦素的表达水平，与高糖组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS处理HUVECs对瘦素基础表达水平未见明显影响（P>0.05）。

图 2(Figure 2)

图 2 外源性H2S抑制高糖对HUVECs瘦素表达的促进作用 Figure 2 Exogenous H2S inhibits the high glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced up-regulation of leptin expression in HUVECs (Mean±SD, n=3). **P < 0.01 vs control group. ++P < 0.01 vs HG-treated group.

如图 3A所示，应用40 mmol/L葡萄糖分别处理HUVECs 3、6、9、12、24 h均能明显上调LEPR的表达水平，于9 h时达到高峰。如图 3B所示，为了检测H2 S对LEPR表达的影响，用400μmol/L NaHS预处理HUVECs 30 min，再用高糖处理9 h，结果显示，能明显抑制LEPR的表达水平，与高糖组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS处理HUVECs对LEPR基础表达水平未见明显影响（P>0.05）。

图 3(Figure 3)

图 3 外源性H2S抑制高糖对HUVECs瘦素受体表达的促进作用 Figure 3 Exogenous H2S inhibits the high-glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced up-regulation of leptin receptor expression in HUVECs (Mean±SD, n=3). **P < 0.01 vs control group; ++P < 0.01 vs HG-treated group.

如图 4所示，Hoechst 33258核染色检测结果显示，40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h可诱导细胞凋亡，使HUVECs的凋亡率从（11.3±3.1）%（图 4A、G）升高至（47.0±8.5）%（图 4B、G），与正常对照组比较，差异显著（P < 0.01）。在高糖处理HUVECs前应用400μmol/L NaHS预处理30 min能显著抑制高糖的致细胞凋亡作用，使HUVECs凋亡率降低至（20.0±2.0）%（图 4C、G），与高糖处理组比较，差异明显（P < 0.01）。与NaHS的作用相似，用50 ng/mL LA预处理HUVECs 1 h也能对抗高糖引起的的致细胞凋亡作用，使HUVECs凋亡率降低至（22.0±5.3）%（图 4D、G）（P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS（图 4E、G）或50 ng/mL LA（图 4F、G）处理HUVECs对细胞凋亡无明显影响（P>0.05）。

图 4(Figure 4)

图 4 外源性H2S与LA抑制高糖引起的HUVECs凋亡 Figure 4 Exogenous H2S and leptin antagonist (LA) reduce high-glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced apoptosis of in HUVECs (Mean±SD, n=3) (Original magnification:×200). **P < 0.01 vs control group; ++P < 0.01 vs HG-treated group. A: Control; B: HG; C: HG+NaHS; D: HG+LA; E: NaHS; F: LA.

如图 5所示，DCFH-DA染色的检测结果显示，40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h可使胞内的DCFH平均荧光强度（MFI，可反映ROS水平）明显增强，从（11.4±1.8）%（图 5A、G）升高至（30.3±2.6）%（图 5B、G），与正常对照组比较，差异显著（P < 0.01），提示高糖可引起HUVECs胞内ROS生成增多。在高糖处理HUVECs前应用400μmol/L NaHS预处理30 min可使高糖引起的胞内ROS堆积减少，MFI减少至（17.8±1.6）%（图 5C、G），与高糖处理组比较，差异明显（P < 0.01）。与NaHS作用相似，应用50 ng/mL LA预处理HUVECs 1 h也能对抗高糖引起的胞内ROS堆积，MFI减少至（17.3±1.5）%（图 5D、G）（P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS（图 5E、G）或50 ng/mL LA（图 5F、G）处理HUVECs对胞内ROS水平无明显影响（P>0.05）。

图 5(Figure 5)

图 5 外源性H2S与LA抑制高糖引起的HUVECs内ROS堆积 Figure 5 Exogenous H2S and leptin antagonist (LA) reduce high-glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced accumulation of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs (Mean±SD, n=3) (Original magnification:×100). **P < 0.01 vs control group; ++P < 0.01 vs HG-treated group. A: Control; B: HG; C: HG+NaHS; D: HG+LA; E: NaHS; F: LA.

如图 6所示，Rh123染色的检测结果显示，40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h可使Rhl23的平均荧光强度（MFI，反映MMP高低）明显减弱，从（33.3±2.7）%（图 6A、G）降低至（18.2±1.7）%（图 6B、G），提示MMP丢失，与正常对照组比较，差异显著（P < 0.01），提示高糖对HUVECs线粒体的损伤。在高糖处理HUVECs前应用400μmol/L NaHS预处理30 min可使高糖引起的MMP丢失减少，MFI升高至（25.5±2.0）%（图 6C、G），与高糖处理组比较，差异明显（P < 0.01）。与NaHS作用相似，应用50 ng/mL LA预处理HUVECs 1 h也能对抗高糖引起的线粒体损伤，MFI升高至（25.9±1.8）%（图 6D、G），P < 0.01）。单独用400μmol/L NaHS（图 6E、G）或50 ng/mL LA（图 6F、G）处理HUVECs对MMP水平无明显影响（P>0.05）。

图 6(Figure 6)

图 6 外源性H2S与LA抑制高糖对HUVECs线粒体的损伤作用 Figure 6 Exogenous H2S and leptin antagonist (LA) attenuate high-glucose (HG, 40 mmol/L glucose)-induced decrease of mitochondrial member potential (MMP) in HUVECs (Mean±SD, n=3) (Original magnification:×100). **P < 0.01 vs control group; ++P < 0.01 vs HG-treated group. A: Control; B: HG; C: HG+NaHS; D: HG+LA; E: NaHS; F: LA.

高血糖可通过多种病理生理机制，如引起血管内皮细胞功能损伤等，导致糖尿病的多种并发症。本研究通过建立高糖损伤HUVECs模型，证实了高糖对血管内皮细胞有明显的损伤作用，表现为降低细胞存活率、增加内皮细胞凋亡、氧化应激（胞内ROS堆积）和线粒体损伤（MMP丢失）等。

高糖对内皮细胞H₂S的生成具有抑制作用，而外源性H₂S可保护高糖诱导的内皮细胞损伤，其机制可能与抗氧化应激、线粒体保护等作用有关。生理浓度的H₂S供体（如Na₂S及NaHS等）可抑制细胞凋亡^[11]，H₂S还可能对细胞内氧消耗起调节作用^[12]。有研究证实，H₂S可通过抗氧化等作用对抗高血糖引起的血管内皮细胞损伤^[13]。还有研究证实，NaHS能显著阻断氧化型低密度脂蛋白引起的HUVECs线粒体膜电位降低，从而保护内皮细胞^[14]。本研究观察到，外源性H₂S能保护HUVECs对抗高糖引起的损伤，具体表现为提高细胞存活率，减少细胞凋亡及ROS的生成，减少线粒体膜电位的丢失。

本研究还发现，高糖在引起HUVECs损伤的同时，还能上调内皮细胞瘦素和瘦素受体的表达。而瘦素拮抗剂可保护HUVECs对抗高糖诱导的损伤，提示瘦素/瘦素受体通路介导高糖诱导的内皮细胞损伤。

有研究证实，外源性H₂S能通过抑制瘦素、p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶1/2通路抑制高糖引起的心肌细胞损伤^{[8, 15]}。但目前H₂S通过调控有关信号通路保护内皮细胞的相关研究较少。本研究观察到，外源性H₂S对HUVECs的保护作用与瘦素拮抗剂类似，因此我们推测这种保护作用可能与抑制瘦素/瘦素受体通路有关。进一步研究发现，外源性H₂S可抑制高糖对HUVECs瘦素以及瘦素受体表达的上调作用，也即抑制了瘦素/瘦素受体通路，这就证实了H₂S对HUVECs的保护作用与抑制瘦素/瘦素受体通路有关。

综上，本研究证实，外源性H₂S可通过抑制瘦素/瘦素受体通路对抗高糖引起的HUVECs损伤，这为深入阐明高血糖对血管内皮细胞损伤的机制以及外源性H₂S对内皮细胞的保护机制提供了新的实验依据，为寻找新的防治糖尿病血管病变的治疗策略提供了理论依据。