阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）是一种渐进性神经退行性病变，目前其病因还不完全明了。其致病因素与多种基因相关^[1]，其中ApoE4（载脂蛋白E，第4亚型）是较为公认的AD危险因子，与散发型AD（sporadicAD,SAD）相关，而散发型AD约占临床AD总病例的95%^[2]。因此，研究ApoE4在AD病症中的作用机制具有重要意义。人类ApoE蛋白有3种亚型，ApoE2、ApoE3和ApoE4，均由299个氨基酸组成^[3]。它们之间的差别仅在于第112位和158位氨基酸的不同，且ApoE2与ApoE3及ApoE3与ApoE4之间仅有一个氨基酸的不同（图1）。由上述氨基酸组成的不同就造成了空间构像和功能上的差异^[4]。与携带ApoE2和E3基因的个体相比，携带单拷贝或双拷贝ApoE4基因的个体患AD的危险性分别增加4倍和12倍^[5]。

图1(Fig.1)

图1 ApoE不同亚型在112和158位氨基酸的区别 Fig.1 ApoE2, E3, and E4 isoforms differ from one another at amino acid residues 112 and/or 158 (grey circles).

淀粉样斑块（amyloid plaques,AP）及神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）是AD的特征性病变。其中，NFT是位于神经元胞内由Tau蛋白超磷酸化后聚集而成^[6]。而Tau 蛋白被异常（超）磷酸化后可使胞内微管稳定性降低，使神经元内的运输和通讯功能受损，最终导致细胞死亡^[7]。研究证明，糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）与Tau 的超磷酸化密切相关^{[8, 9]}，其异常表达与AD相关。

对ApoE4在AD中作用机制的研究，目前主要分为两类，一是Aβ依赖性病理机制^{[10, 11]}，即：ApoE可以亚型依赖形式促进Aβ斑的形成（ApoE4>ApoE3>ApoE2）。同样ApoE的脂质复合体也能以亚型依赖形式清除Aβ来减少Aβ斑(ApoE2>ApoE3>>ApoE4)。另一条途径是Aβ非依赖性病理机制^{[12, 13]}，即：ApoE4可在神经元内被蛋白酶切割，产生去除C- 末端的片段[ApoE4（1-272）]，该片段具有神经元毒性可通过损害线粒体及突触再生功能而产生AD病症^[14]。ApoE4是否可影响Tau的磷酸化，目前还未见报道。

U87脑星形胶质瘤细胞系购自于南京凯基生物公司。胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培养基及0.25%胰蛋白酶均为Gibco 公司产品。pIRES-EGFP 表达质粒（Clonetech 公司），重组质粒ApoE4/pIRES-EGFP 和ApoE3/pIRES-EGFP为本研究组构建，高纯度质粒提取试剂盒（上海生工生物公司），ApoE-siRNA（正向：GCUGGGUGCAGACACUGUCUGAGCA 及反向：UGCUCAGACAGUGUCUGCACCCAGC） 和对照siRNA均由美国Invitrogen公司合成。细胞转染脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司），兔抗人p-Tau 抗体（CST 公司，Cat no. 11834S），兔抗人GSK-3β抗体（Cat no. BA0906-1）及羊抗兔IgG-HRP（二抗）均购自武汉博士德公司。显色剂ECL（Perkin-Elmer公司）。

U87细胞混悬于2 mL/孔的DMEM高糖培养基中（含1% P/S（双抗）和10% FBS），在6 孔培养板中，于37 ℃，5% CO2培养至细胞密度达70%~80%时进行质粒转染。

分别将ApoE4/pIRES-EGFP、ApoE3/pIRES-EGFP及空白对照质粒（pIRES-EGFP）与脂质体Lipofectamine2000混合（1 μg∶2 μL）后转染U87细胞。为了建立ApoE过表达的细胞平台，U87神经胶质细胞瘤细胞被分为3个转染组：第1组为对照质粒pIRES- EGFP载体（即空白质粒，图2A），第2组是ApoE3/pIRES- EGFP重组质粒（即ApoE3过表达组，图2B），第3组是ApoE4/pIRES-EGFP 重组质粒（即ApoE4 过表达组，图2C）。然后于荧光显微镜下观察被转染细胞的绿色荧光。最后提取各组总蛋白用于下一步实验。

图2(Fig.2)

图2 不同EGFP非融合重组质粒转染U87细胞的绿色荧光图像 注解 Fig.2 Expression of non-fused EGFP in U87 cells 24 aftertransfection with ApoE4,ApoE3 and pIRES-EGFP vector plasmidsdetected under the inverted fluorescent microscope (Originalmagnification: ×20).

于上述细胞转染24 h 后弃培养液，用预冷的PBS洗涤2次，吸净PBS后加入RIPA裂解液，在冰浴上孵育20 min 后充分刮取贴壁细胞后转移至离心管中，于12 000 r/min，4 ℃下离心15 min，取上清总蛋白于新离心管中。应用Bradford法进行蛋白定量，备用。

上述蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，将胶中蛋白转移至PVDF膜上并在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，TBST（20 mmoL Tris·Cl，150 mmoL NaCl，0.1%Tween-20，pH7.4）洗涤2次，然后分别加入适当的一抗于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温孵育1 h：兔抗人GSK-3β抗体按1∶400 稀释；兔抗人p-Tau 抗体按1∶800 稀释。接着用TBST 洗涤3 次，然后用羊抗兔IgG-HRP（二抗，1∶5000）于室温中再孵育1 h，TBST洗涤3 次。最后将吸干水分的PVDF 膜置于BioRad荧光成像仪的托板上，在膜上均匀加上ECL 化学发光液并进行自动曝光拍照。选取曝光适当的照片进行分析。

将U87细胞培养至密度达70%~80%（见1.2.1），用脂质体Lipofectamine 2000 分别与双链ApoE-siRNA及对照siRNA混匀，室温放置15 min。而后加入U87细胞内，使siRNA的终浓度为150 nmol/L继续孵育24 h后提取实验组和对照组的细胞总蛋白。最后用Western blotting法检测相应蛋白的含量（见1.4）并进行统计学对比。

应用SPSS 18.0 软件处理至少3 次独立实验的数据，以平均数±标准差表示。两两比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05认为差异具有统计学意义。

在转染24 h后，于倒置荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白EGFP的荧光信号，以判明转染质粒在细胞中的过表达情况。结果表明：ApoE4，ApoE3重组质粒及对照质粒均成功转染入宿主细胞并表达出非融合的EGFP指示蛋白。

从2.1所转染的3组U87细胞中分别提取其总蛋白后利用Western blotting 检测各实验组的GSK-3β、Tau蛋白的磷酸化水平（图3A）并进行统计学处理。结果显示，与对照组相比，GSK-3β蛋白水平的相对变化值分别为：ApoE4 组（1.819±0.130，P<0.01，n=3）和ApoE3 组（1.336±0.130，P<0.01，n=3），差异具有统计学意义；且ApoE4 和ApoE3 组间也有差异（P<0.01，图3B）。这一结果表明，ApoE4具有更强的上调GSK-3β作用。同时，与对照组相比，ApoE4和ApoE3使p-Tau蛋白变化的相对值分别为1.587±0.027（P<0.01，n=3）和1.436±0.026（P<0.01，n=3），差异均具有统计学意义；同样，ApoE4和ApoE3 组间也有差异（P<0.01）。这一结果也表明，ApoE4较ApoE3有更强的增加Tau蛋白磷酸化水平的作用（图3C）。有趣的是为何ApoE3也可使Tau相关的该激酶表达上调及Tau磷酸化水平的增加。

图3(Fig.3)

图3 ApoE4和ApoE3对GSK-3β水平及Tau磷酸化的影响 Fig.3 Both ApoE4 and ApoE3,especially the former,upregulate the expression of GSK-3β and enhance thephosphorylation levels of Tau. **P<0.01 vs control group,##P<0.01 vs ApoE3 group.

为进一步验证GSK-3β与Tau 蛋白磷酸化水平与ApoE 相关，我们将干扰ApoE 表达的siRNA（ApoEsiRNA）转染至U87 细胞，24 h 后提取总蛋白并利用Western blotting 检测对照组和干扰组的GSK-3β表达和Tau蛋白磷酸化的变化（图4A）。结果表明，干扰组的GSK-3β的表达与对照组相比明显降低（0.544±0.058，P<0.001，n=3，图4B）。同样，siRNA 干扰后磷酸化Tau蛋白的相对变化值与对照组相比也明显降低（0.474±0.060，P<0.01，n=3，图4C）。这些结果进一步表明ApoE过表达可使GSK-3β水平升高且可增加Tau蛋白的磷酸化水平。

图4(Fig.4)

图4 ApoE-siRNA对GSK-3β及Tau蛋白的磷酸化水平的影响 Fig.4 ApoE-siRNA down-regulates the expression of GSK-3β and decreases the phosphorylationof Tau. ***P<0.001 and **P<0.01 vs control group.

本研究的结果显示：ApoE4的表达量与GSK-3β的表达及Tau蛋白的磷酸化水平成正相关。提示ApoE4在AD中的作用机制之一可能是通过上调GSK-3β而使Tau蛋白的磷酸化水平上升以导致AD病症。对ApoE4在AD中的作用机制提出了新的解释。

AD是一种多因素引起的中枢神经退行性疾病，我国现有AD病患者达350多万，65岁以上老年人总患病率为5.9%，与西方国家资料接近^[15]。至今AD的发病机制尚未完全明了，目前主要有：淀粉样多肽（Aβ）致病说^[16]、Tau 蛋白超磷酸化致病说^[7]和遗传变异致病说^[17]，等。在ApoE不同亚型的遗传背景因素中，ApoE4亚型被认为是AD病的危险因子^[18]而ApoE3 和ApoE2 亚型不是。研究表明，GSK-3β是Tau 磷酸化的主要激酶之一^{[8, 19]}，而异常磷酸化的Tau可导致神经元功能的减退甚至死亡。从而认为GSK-3β可通过使Tau超磷酸化促进AD的病程进展。但ApoE4与GSK-3β间的相互关系还未见报道。

在正常情况下ApoE在脑中主要由星形胶质细胞表达，而目前所使用的人神经源性细胞系（如M-17，SH-SY5Y等）在正常情况下ApoE的表达水平很低（只有当受某些应激刺激或受损伤时才表达ApoE）^{[3, 5]}。表明在脑星形胶质细胞中存在特有的ApoE基因调控系统。因此，我们在实验中采用U87人脑星形胶质细胞源性细胞系进行研究。拟通过在U87细胞中表达ApoE4和ApoE3来探讨它们在信号转导和功能上的差异。

本研究发现，在U87细胞中过表达ApoE4 或ApoE3均使得GSK-3β的表达上调及增高Tau蛋白的磷酸化水平。而当用ApoE的抑制性siRNA处理后GSK- 3β的表达及Tau蛋白的磷酸化水平（p-Tau）均显著下降。值得注意的是：ApoE4过表达组与ApoE3过表达组之间存在着显著差异（P<0.01），即如果将ApoE3（组）作为对照则ApoE4（组）仍具有显著上调GSK-3β表达和增高p-Tau水平的作用。这可能是ApoE4作为AD危险因子的作用之一。对于ApoE3 在本实验系统中也可上调GSK-3β表达的现象，我们认为ApoE3的过表达使细胞内质网中未折叠蛋白增多而通过其感应分子IRE1（inositol-requiring enzyme 1，肌醇依赖酶1）产生内质网应激反应（ER stress），即未折叠蛋白反应（unfoldedprotein response，UPR）。从而导致NF-kb 转录因子表达增高^{[20, 21]}继而引起GSK-3β的表达上调。采用转录因子结合序列的分析发现（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3） ，在GSK- 3β基因的启动子^[22]中存在NF-kb的转录结合位点。而ApoE4较ApoE3具更为显著的上述作用则是源于它们分子间在空间构象上的差异^[3]。基于上述资料和分析，本研究的结果表明ApoE4 可能通过上调GSK-3β的表达而增强Tau的磷酸化并以此促进AD病程的发展，为探索ApoE4在AD中的作用机制提供了新的实验依据。