2国立癌症研究所肿瘤生物与遗传实验室，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达市美国
2Laboratory ofCancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA
乳腺癌的转移复发是乳腺癌死亡的主要原因，但转移复发的机制仍有待深入研究。自分泌在乳腺癌的发生发展和转移中起重要作用，乳腺癌细胞通过自分泌多种蛋白质，包括生长因子，如神经细胞生长因子[1]、血小板源生长因子[2]、肝细胞生长因子[3]和胰岛素样生长因子2[4]等促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及癌细胞在异位的生长。最近的研究发现,癌细胞可自分泌神经生长因子（nerve growth factor,NGF）[1]和神经生长因子前体（precursor of nerve growth factor,proNGF）[5]促进乳腺细胞的上皮间质转化及侵袭，乳腺浸润性导管癌和proNGF的表达高度相关；相对于NGF，proNGF只需极低的浓度就可促进乳腺癌细胞侵袭，提示乳腺癌细胞通过自分泌proNGF促进乳腺癌转移的可能性更大，因此研究proNGF 促进乳腺癌转移的机制尤为重要。Demont的研究表明[5]，proNGF促进乳腺癌细胞侵袭与Src 的激活相关联，尽管Src[6]的异常激活与肿瘤转移有关，但proNGF促进乳腺癌转移是否依赖于Src的激活，以及Src的激活的是何种下游分子却有待进一步阐明，因为Src有多种底物[7]，参与不同的信号途径[8, 9]。
埃兹蛋白（ezrin）是细胞骨架蛋白ERM（ezrinradixin-moesin）家族中的一员，相对分子质量为69 000，通过连接细胞膜和细胞骨架参与许多细胞动力学过程，如丝状伪足的形成和稳定、细胞黏附、迁移等[10, 11, 12]。研究表明，ezrin表达升高与乳腺癌的不良预后有关[13]，敲低乳腺癌细胞ezrin可抑制乳腺癌细胞的侵袭能力[13]。不但ezrin 表达高低与乳腺癌转移有关，而且，ezrinThr567的磷酸化与乳腺癌转移有关系，因为ezrin的激活有赖于ezrin Thr567的磷酸化[14]。ezrin Thr567[13]和ezrin Tyr477[15]磷酸化与肿瘤转移有关。Mak等的研究表明[15]，Src是磷酸化ezrin Tyr477的激酶。
由于proNGF可使Src激活，而Src可使ezrin Tyr477磷酸化，我们假设proNGF促进乳腺癌细胞的侵袭的机制是通过其激活Src而使ezrin Tyr477磷酸化。我们的研究加深了对proNGF促进乳腺癌转移机制的了解。
1 材料和方法 1.1 细胞株人乳腺癌MDA-MB-231 细胞株购自中科院上海细胞库。人乳腺癌MCF-7细胞株购自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，美国）。
1.2 主要试剂L15、DMEM细胞培养液及胰酶购自Hyclone公司（美国）；胎牛血清购自Gibco公司（美国）；proNGF重组蛋白购自Alomone公司（以色列）；SKI-606购自Selleck公司（美国）；Transwell小室、Matrigel基质胶、PVDF膜购自BD公司（美国）；兔抗人pTrkA、兔抗人TrkA、兔抗人pSrc、兔抗人Src、兔抗人ezrin、兔抗人pezrin Thr567购自Cell Signaling Technology 公司（美国）；兔抗人pezrin Tyr477 购自Sigma 公司（美国）；鼠抗人β-actin、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司（中国）；LipofectamineTM3000转染试剂以及引物合成购自Invitrogen 公司（美国）；pEnter-His，pEnter-His-ezrin质粒购自山东维真生物科技有限公司（中国）；基因定点突变试剂盒购自碧云天公司（中国）。
1.3 细胞培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 培养于含10%胎牛血清的L-15培养基中，人乳腺癌细胞株MCF-7培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃，5% CO2培养箱内培养，常规更换生长液，消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。
1.4 Transwell小室检测细胞的侵袭能力取5 μL Matrigel基质胶溶于95 μL DMEM基础培养基，加入到Transwell小室（孔径8 μm）中，在37 ℃孵箱静置1 h，小心吸除小室中未凝液体备用。取对数生长期细胞，消化离心，用无血清培养基稀释细胞至3×105/mL，每个小室中加入300 μL细胞悬液，下室每孔加入含5%胎牛血清的培养基800 μL，按照实验目的在上室中加入一定浓度的proNGF，培养16 h后取出小室，用棉签擦去小室上层未侵袭的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min。显微镜下拍摄，在400×视野下取上、下、左、右、中5个视野拍摄，计数。侵袭增长率=（实验组细胞数-对照组细胞数）/对照组细胞数。
1.5 免疫印迹实验检测蛋白表达将细胞消化后接种到12孔板，1×104个细胞每孔。在细胞贴壁之后，用无血清培养基饥饿处理24 h，再加药处理。处理完毕后弃上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，吸净液体。将细胞放置在冰上，加入1 mL预冷的PBS，细胞刮刀刮下细胞，离心收集。向每管细胞中加入100 μLRIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 g，4 ℃离心10 min，取上清，BCA法测定总蛋白浓度。蛋白样品上样前加入上样缓冲液，100 ℃金属浴加热5 min，12 000 g离心3 min，可直接用于蛋白免疫印迹，每孔上样等量总蛋白。SDS-PAGE分离蛋白，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶摇床上室温封闭1 h，加入相关蛋白的一抗4 ℃孵育过夜（一抗均以1∶1000比例稀释于5%BSA中）；二抗室温孵育1 h（羊抗鼠、羊抗兔二抗均以1∶3000比例稀释于5%脱脂牛奶中），ECL显影。
1.6 质粒转染转染前1 d，4×104细胞接种于24孔板，在24 h内细胞汇合达到70%~90%。分别将1 μg质粒，2 μL lipo3000和2 μL p3000溶于50 μL Optimem无血清培养基中，混匀室温静置5min，再将质粒和lipo3000、p3000混合，室温下静置20 min。将100 μL 混合好的复合物加到培养板中，来回轻柔摇晃细胞培养板，在CO2培养箱中37 ℃温育24~48 h后，进行转染后的后续实验。
1.7 基因定点突变根据基因定点突变试剂盒上说明，设计并合成引入ezrin Tyr477突变位点的一对互补PCR引物，将编码野生型ezrin 第477位酪氨酸（ezrin Y477）的密码子TAC改为TTC，使ezrin第477位酪氨酸转变苯丙氨酸，成为ezrin Y477F突变体，使连接后的PCR产物成为ezrin显性负突变质粒pEnter-His-ezrinY477F。这一对引物的序列为：5'-CCACCACCCCCCGTGTTCGAGCCGGTGAGCTAC-3'；5'-GTAGCTCACCGGCTCGAACACGGGGGGTGGTGG-3'。黑体碱基为引入的突变，使ezrin 第477位酪氨酸转变苯丙氨酸（ezrinY477F）。以pEnter-His-ezrin质粒作为模板，按照说明书加入上述引物以及PCR反应试剂，PCR反应进行基因点突变。反应完成后加入DpnⅠ酶消化1 h，降解掉模板质粒。DpnⅠ酶消化完毕后直接取10 μL产物加入到100 μL感受态细菌中转化，涂布在卡那抗性平板上，培养过夜，次日挑取单个克隆扩增鉴定。
1.8 统计学分析实验数据均以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用SNK法。当P<0.05时认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 proNGF促进乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的侵袭能力Transwell侵袭实验显示，对MDA-MB-231细胞和MCF-7 细胞分别用2.5、5、10 ng/mL 这3 个浓度的proNGF处理16 h后，随着proNGF浓度的增加，MDAMB-231细胞和MCF-7细胞穿过基质胶的数量逐步增加，说明两种乳腺癌细胞的侵袭能力随着proNGF浓度升高而逐渐增强（图1A）。与对照组相对比，MDAMB-231 细胞在10 ng/mL 的proNGF处理下侵袭增长率为686%（图1B），MCF-7为388.9%（图1C）。
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图1 proNGF促进乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的侵袭 Fig.1 proNGF promotes the invasion of breast cancer cell line MDA-MB-231 and MCF-7. A: Transwell assay (Originalmagnification: ×400); B,C: Quantitative analysis of cell invasion. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.005. |
用proNGF 处理MDA-MB-231 细胞60 min，与对照组相比，5、10 ng/mL proNGF处理MDA-MB-231 细胞，ezrin的表达和ezrin Thr567位点的磷酸化均未产生变化，而ezrin Tyr477 位点的磷酸化随着proNGF刺激显著性提高，并且具有浓度依赖效应（图2A）。如图2B所示，ezrin Tyr477位点的磷酸化随着proNGF（10 ng/mL）处理时间增长而递增，表现出时间依赖效应。
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图2 proNGF促进MDA-MB-231 细胞ezrin Tyr477的磷酸化 Fig.2 proNGF increases the phosphorylation of ezrinTyr477 in MDA-MB-231 cells in a concentrationdependent(A) and time-dependent (B) manner. |
proNGF促进乳腺癌细胞转移，并且和Src激酶激活相关联[5]。考虑到有报道ezrin Tyr477位点磷酸化是由Src 激酶激活所致，我们研究了proNGF 促进ezrinTyr477的磷酸化是否是由Src激酶激活引起。如图3A所示，随着proNGF处理MDA-MB-231 细胞时间的延长，Src Tyr416水平逐渐升高，直至120 min处于最高，表明proNGF处理激活了Src激酶。当用Src激酶特异抑制剂SKI-606（10 μmol/L）处理乳腺癌细胞MDAMB-231 后（图3B），不仅抑制了proNGF对Src 激酶的激活，而且ezrin Tyr477位点磷酸化也相应的降低。
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图3 proNGF通过激活乳腺癌细胞MDA-MB-231Src激酶使得ezrin Tyr477磷酸化 Fig.3 proNGF increases the phosphorylation of ezrinTyr477 by activating Src in MDA-MB-231 cells. A:proNGF activates Src by increasing thephosphorylation of Src Tyr416 in a time-dependentmanner; B: Src-specific inhibitor SKI-606 inhibits Srcactivation and the phosphorylation of ezrin Tyr477induced by proNGF. |
用基因定点突变技术，将pEnter-His-ezrin 质粒中ezrin 基因477 位点的酪氨酸突变成苯丙氨酸，从而使ezrin失去在477位点磷酸化的能力。这种pEnter-HisezrinY477F质粒对野生型ezrin Tyr477 的磷酸化起抑制作用，pEnter-His-ezrinY477F是显性负突变质粒。因此，在细胞中过表达pEnter-His-ezrinY477F，可以研究ezrin Tyr477的磷酸化在proNGF促进乳腺癌细胞侵袭中的作用。在MDA-MB-231细胞中，瞬时转染pEnter-His 空质粒载体、pEnter-His-ezrin 质粒、pEnter-HisezrinY477F质粒，免疫印迹检测ezrin、phos-ezrin Tyr477水平。转染了pEnter-His-ezrin 质粒和pEnter-HisezrinY477F质粒的细胞ezrin表达水平显著性升高，前者phos-ezrin Tyr477 水平也相应地升高，而后者phosezrinTyr477未发生改变（图4A）。用10 ng/mL proNGF处理转染了pEnter-His 空载体质粒和pEnter-HisezrinY477F质粒的MDA-MB-231 细胞，再在体外做Transwell小室实验，16 h后检测各组MDA-MB-231细胞的侵袭能力。转染空载体的一组，proNGF处理之后MDA-MB-231细胞侵袭数提高了508%；而转染pEnter-His-ezrinY477F 质粒的一组，proNGF 刺激处理之后MDA-MB-231 细胞侵袭数只提升了84%（图4B、C）。说明ezrinY477F 突变，抑制了proNGF 促进MDAMB-231 细胞侵袭的作用，即ezrin Tyr477 的磷酸化在proNGF促进乳腺癌细胞侵袭中起关键作用。
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图4 pEnter-His-ezrinY477F显性负突变质粒抑制proNGF促进的MDA-MB-231乳腺癌细胞ezrin Tyr477磷酸化和侵袭 Fig.4 Dominent negative plasmid pEnter-His-ezrinY477F inhibits phosphorylation of ezrin Tyr477 and invasion induced byproNGF in MDA-MB-231 cells. A: pEnter-His-ezrinY477F inhibits phosphorylation of ezrin Tyr477 induced by proNGF inMDA-MB-231 cells; B Transwell assay (Original magnification: × 400),C: pEnter-His-ezrinY477F inhibited invasion of MDAMB-231 cells induced by proNGF. *P<0.05,***P<0.005. |
我们的研究表明：ezrin Tyr477的磷酸化在proNGF促进乳腺癌细胞侵袭中起关键作用，proNGF促进乳腺癌细胞的转移依赖于ezrin Tyr477的磷酸化。乳腺癌细胞能通过自分泌NGF[16]和proNGF[5]。NGF 能抑制乳腺癌细胞的凋亡[17]，促进乳腺癌细胞增殖[18]，NGF也与促进乳腺癌转移有关[1, 19, 20]，但体外实验表明，proNGF 促进乳腺癌细胞的侵袭所需浓度比proNGF高十多倍，乳腺癌细胞对proNGF的应答更为敏感[5]，这是本研究选择proNGF而没有选择NGF作为研究对象的原因之一。NGF和proNGF结合的受体及信号转导途径的差异，可能是其促进乳腺癌细胞侵袭差异性的基础。NGF通过结合p75NTR和TrkA 异二聚体受体[21]激活NF-κB和MAPK信号通路，proNGF是通过和异二聚体受体TrkA和sortlin结合，激活下游Src激酶[5, 21]。本研究结果也显示，proNGF也可激活Src激酶，proNGF能大幅增强乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7的侵袭能力，且其对MDA-MB-231的效应要强于MCF-7。
由于proNGF促进乳腺癌侵袭过程中激活了Src激酶[5]，且有文献报道表明，ezrin Tyr477位点的磷酸化是由Src激酶的激活所致[15]，于是我们进一步研究proNGF促进乳腺癌细胞的侵袭是否与ezrin Tyr477的磷酸化有关。实验结果表明，proNGF刺激的乳腺癌细胞，ezrin的表达和ezrin Thr567 的磷酸化均没发生改变，但是ezrin Tyr477的磷酸化水平显著升高，且这种磷酸化水平的升高是由Src激酶的激活所致，因为Src激酶特异性抑制剂SKI-606能抑制proNGF对癌细胞Src激酶的激活，同时降低ezrin Tyr477磷酸化水平。为了进一步研究proNGF 促进乳腺癌细胞侵袭是否依赖于ezrinTyr477 的磷酸化，我们构建了显性负突变质粒pEnter-His-ezrinY477F转染MDA-MB-231 细胞，实验结果表明，显性负突变质粒抑制proNGF对乳腺癌细胞侵袭的促进作用，说明proNGF促进乳腺癌细胞侵袭依赖于ezrin Tyr477 的磷酸化，ezrin Tyr477 的磷酸化在proNGF促进乳腺癌细胞的侵袭中起关键作用。值得进一步研究的是，为什么ezrin Tyr477磷酸化能促进侵袭乳腺癌细胞的迁移。
综上所述，ezrin Tyr477 磷酸化在proNGF促进乳腺癌细胞侵袭中扮演非常关键的角色，这提示ezrin是proNGF促进乳腺癌侵袭信号途径中重要的信号分子，抑制ezrin Tyr477磷酸化及可能的下游信号分子，可能成为防治疗肿瘤的转移的新策略。
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