2016, Vol. 36
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）引起的炎性痛[1]是目前临床工作中最为常见的病理性疼痛之一，有病程长久、迁延反复和耗费巨大的特点。目前RA炎性痛治疗仍没有十分有效的方法，临床用药各有特点。他汀类药物可使多种蛋白难以进行异戊二烯化修饰，抑制炎症[2]。辣椒素受体（TRPV1）拮抗剂作为新型镇痛药正在被开发，但部分拮抗剂因体温过高的不良反应致研究中止[3]。有研究[4-6]提出可通过抑制络氨酸激酶A（TrkA）表达可减轻痛觉过敏，TrkA拮抗剂作为新型镇痛药正被广泛研究，有望用于临床。TrkA、TRPV1是炎性痛产生维持过程中的重要信号分子[4-9]。蜂毒干粉含蜂毒肽、蜂毒明肽等多种生物活性物质对治疗RA及炎性痛有效[10-12]，但关于蜂毒对炎性痛TRPV1的调控作用机制的报道研究较少，目前还没有蜂毒消炎镇痛与TrkA、TRPV1关系的研究。本实验研究采用CIA大鼠造模，治疗采用蜂毒干预，观察双侧足跖厚度、肿胀关节评分和痛阈变化，初步验证蜂毒治疗RA炎性痛的有效性，探讨蜂毒对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠的治疗作用及其可能的作用机制，并采用免疫组化观察背根神经节TRPV1表达、western blotting检测TrkA含量，初步探讨TrkA、TRPV1与炎性痛的相关性。这不仅有利于蜂毒的规范使用，还为开发新作用靶点消炎镇痛药物提供新的思路。
1 材料和方法 1.1 实验动物成年雄性Wistar大鼠15只，体质量180~220 g，购于南方医科大学动物中心。
1.2 材料和仪器小牛Ⅱ 型胶原（chondrex公司），不完全弗氏佐剂（IFA）、蜂毒（BV）（Sigma-Aldrich公司）。TRPV1、TrkA试剂盒（abcam公司）。数显卡尺（Forgestar公司）。life science model 390 热痛测试仪（美国IITC公司）。其余材料由南方医科大学试剂中心提供。
1.3 方法 1.3.1 动物模型的建立和分组SPF级实验室自由饲养4 d。随机分为正常对照组、模型组、BV组，每组5只。实验前1 d（d0）将小牛Ⅱ 型胶原试剂（10 mg装）存于4 ℃ 过夜。实验第1天时于无菌条件下将其与IFA在等体积冰浴中混合充分乳化。检测时抽取一滴乳化剂滴入盛水烧杯中，均匀铺开为准。4 ℃ 冰箱保存备用。实验第1天（d1）时模型组和BV组大鼠于尾根部注射小牛Ⅱ 型胶原和IFA的乳化剂0.2 mL初次免疫，正常对照组于尾根部注射生理盐水0.2 mL。d8 时模型组和BV组再次注射乳化剂0.2 mL加强免疫，正常对照组再次注射生理盐水0.2 mL。从d10起每日造模大鼠足跖肿胀者逐渐增多，活动减少，行走拖步。14 d内造模大鼠均出现CIA体征，足跖厚度不同程度肿胀，且肿胀未见明显消退，均可进行下一步实验。
1.3.2 实验方法（1）足跖厚度：连续7 d采用数显卡尺，以大鼠足跖底正中面与足掌关节掌骨正中矢状面为轴，双下肢各测量3 次，求和取平均值；（2）肿胀关节评分（AI）：连续7 d，按AI评分标准对大鼠四肢的各个关节的积分累计求和，即为每只鼠的AI。AI评分标准：0分，无红肿；1分，小趾关节轻度红肿；2分，小趾关节和足跖肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪、关节肿胀；（3）痛阈：在最后1 d 进行测量。设RI=35，上限为20 s，将热痛测试仪热辐射光源焦点对准大鼠下肢足跖底正中皮肤，每只大鼠双下肢各测量2次，每次间隔10 min，求和取平均值。
1.3.3 治疗BV组治疗首先固定大鼠使其无法自由转动，用蒸馏水和蜂毒干粉配制3 mg/mL的蜂毒溶液，用1 mL注射器抽取，从d15起于大鼠单侧足三里穴注射0.1 mL。1次/d，连续治疗7 d。取穴参照《实验针灸学》定位法。模型组注射生理盐水，方法、穴位、剂量和疗程同BV组。正常对照组不干预。
1.3.4 免疫组化检测DRG内TRPV1含量变化干预结束后戊巴比妥钠腹腔麻醉，剪开膈肌、胸壁，暴露心脏；经左心室行主动脉插管，左手固定心脏，右手持针从心尖搏动处插入左心室、主动脉弓，先生理盐水快冲，右心耳泛白剪开右心耳，后用4%多聚甲醛灌注先快后慢固定。固定后取腰段脊柱，沿坐骨神经逆行追踪L4-6神经至椎间孔，轻用力将DRG从椎间孔取出。标本常规脱水，石蜡包埋，切片厚4 μm。常规脱蜡至水，室温孵育，PBS冲洗，热修复，封闭，滴加1∶100稀释TRPV1一抗（abcam），4 ℃ 过夜。冲洗，二抗标记，孵育，漂洗等，显色，冲洗，复染，脱水，封固，置目镜（×200）测微尺下观察阳性细胞计数。
1.3.5 Western blotting 检测DRG中TrkA 的含量改变标本DRG（L4-6）取材步骤同免疫组化。称质量后研碎，裂解，离心，取上清液，蛋白浓度测定等。清洗玻片，制胶，上样，电泳跑胶，转膜，封闭，按1∶5000稀释TrkA一抗（abcam）、二抗依次孵育过夜并洗3次，最后显色，曝光，扫描图片，用Quantity One 软件对Western blotting条带进行灰度分析，记录其灰度值。蛋白质的相对含量用目的蛋白与内参条带光密度的比值表示，按计量资料进行统计分析。
1.4 数据处理及统计方法采用t检验、ANOVA等进行比较，结果以均数±标准差形式表达，P＜0.05 表示差异有统计学意义（SPSS17.0）。
2 结果 2.1 足跖厚度与正常对照组相比（表 1），CIA大鼠足跖厚度明显增加，模型组在NS注射7 d后足跖厚度变化不明显；BV组在给予BV治疗3 d内与模型组相比足跖厚度下降不明显，治疗4、5 d后下降明显（P＜0.05），治疗6、7 d后厚度降至与正常对照组相似（P＜0.05）。BV组差值与模型组、正常对照组有明显差异（P＜0.05），模型组和正常对照组差值无明显差别（P>0.05）。
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表1 各组大鼠双下肢足跖厚度的变化 Tab. 1 Changes of the rats' hind paw thickness（Mean±SD, mm） |
BV组给予BV治疗3 d后与模型组相比AI评分无明显差别（P>0.05）；在治疗4~7 d间AI降低明显，与模型组有显著差异（P＜0.05）；正常对照组大鼠不造模未见肿胀，与CIA大鼠有明显差别（表 2）。
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表2 各组大鼠四肢肿胀关节评分的变化 Tab. 2 Changes of the rats' AI（Mean±SD, score） |
模型组和BV组痛阈明显低于正常对照组，BV组痛阈高于模型组（P＜0.05）；模型组、BV组TRPV1阳性细胞百分数、TrkA含量显著高于正常对照组（P＜0.05），BV组TRPV1 阳性细胞数、TrkA 含量低于模型组（P＜0.05，表 3、图 1）。
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表3 各组大鼠DRG内TRPV1阳性细胞百分数和TrkA含量 Tab. 3 Pain thresholds and percent of TRPV1 positive cells and expression of TrkA (Mean±SD, n=5) |
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图1 不同组大鼠背根神经节中TrkA、β-actin蛋白的表达 Fig.1 Expressions in TrkA and β-actin protein in the dorsal root ganglion of rats in different groups.t: TrkA; β: β-actin; CN: Control group; M: Model group; BV: Bee Venom group. |
类风湿关节炎引起的炎性痛[1]是严重影响人们生活工作的常见病理性疼痛。TRPV1 拮抗剂可治疗疼痛，TrkA也被用于新型镇痛药研究[13]。蜂毒能刺激垂体-肾上腺皮质，抑制炎症因子和前列腺素合成酶等的表达[10-12]，蜂毒对治疗RA有效[10-15]，但缺少蜂毒对炎性痛TRPV1 的调控作用机制的报道研究。背根神经节（DRG）是伤害性刺激的传入通道，包含多种疼痛相关的受体、离子通道以及信号转导分子。
辣椒素受体TRPV1[7-9, 16-18]属热敏性、伤害性阳离子通道，主要在DRG、节状神经节和脑三叉神经节等分布；在IL1-β、IL15、TNF-α等促炎作用下PI3K、PKC和CaMKⅡ等磷酸化TRPV1的部分位点而呈致敏状态。TRPV1基因敲除小鼠注入CFA、角叉胶或TNF-α等后不再痛敏[9, 19]，证明TRPV1是炎性痛必不可少的疼痛刺激信号整合者。丝氨酸苏氨酸激酶[20]p38MAPK通过磷酸化和级联反应参与炎性痛，RA 炎性痛大鼠p38MAPK水平升高，其抑制剂SBZO358O则减轻疼痛，证明它也是炎性痛中的重要分子[7, 21-22]。
TrkA 是近年来消炎镇痛作用靶点研究的热门分子。它属于原癌基因酪氨酸蛋白激酶家族，是NGF的高亲和力受体[4, 23]，NGF（TrkA）可通过两条途径[19]影响TRPV1：（1）创伤或炎症时配体NGF堆积，同时DRG表达受体TrkA，NGF与TrkA 高度结合，激活PLC、PI3K等，从而降低TRPV1开放阈值；（2）局部产生NGF并沿外周神经逆行至DRG与TrkA结合，激活P38MAPK的转录和翻译，上调DRG内TRPV1表达，TRPV1再被运输到伤害感受器末梢，引起阳离子（Ca2+为主）从胞外进入胞内，产生动作电位，通道开放，同时进一步释放更多的炎症因子NGF、5-HT、TNF-α、组胺等，降低痛阈，并投射到大脑皮层，产生疼痛。
本研究采用IHC-P观察DRG中TRPV1的阳性细胞百分数和western blotting检测TrkA含量。结果发现CIA炎性痛大鼠的足跖厚度和AI高于正常对照组、痛阈低于正常对照组；DRG中TRPV1阳性细胞百分数高于正常对照组，即炎性痛时DRG中TrkA、TRPV1的表达水平亦升高；提示TRPV1和TrkA共同参与了炎性痛的产生，两者存在正相关。因此，本研究认为炎性痛发生时TrkA、TRPV1 水平上升，痛阈下降，TrkA 与TRPV1是炎性痛产生时疼痛信号转导的重要分子。
结果还发现，CIA 炎性痛大鼠在BV治疗后（BV组）足跖厚度和AI较模型组低，痛阈较模型组高；DRG中TRPV1阳性细胞百分数、TrkA含量BV组低于模型组，即蜂毒治疗炎性痛大鼠其DRG中TRPV1、TrkA的表达水平下降；提示蜂毒抑制炎性痛大鼠DRG 中TrkA、TRPV1的表达水平。本研究初步认为蜂毒通过抑制炎性痛大鼠DRG中TrkA、TRPV1的表达水平，从而影响TRPV1 对疼痛的调控作用。TrkA 可能是TRPV1疼痛信号转导通路的重要分子。
本研究认为蜂毒能够抑制炎性痛大鼠DRG 中TrkA、TRPV1的表达水平，从而减轻炎性痛。TrkA与TRPV1是疼痛信号转导的重要分子，两者的相关性可能是消炎镇痛的途径之一。NGF（TrkA）/MAPK（p38MAPK）/TRPV1可能是炎性痛产生和维持过程中的重要信号通路[4-9, 21-23]。研究的不足之处是尚未采用排除性试验方法证实蜂毒能够通过抑制TrkA的表达水平达到抑制TRPV1在疼痛信号转导中的调控作用，应进一步研究其中一种分子拮抗剂使用后另一种分子表达的变化，从而更全面证实TrkA与TRPV1在疼痛信号转导通路中的相互关系。这有利于蜂毒临床运用的规范化，并为开发新作用靶点的消炎镇痛药提供新的理论依据。
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