帕金森病（Parkinson's disease,PD）是由于中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元的变性丢失，导致出现静止性震颤等一系列运动障碍。然而，越来越多的临床资料表明：PD病人往往还伴随非运动症状，如抑郁、焦虑和认知功能减退，甚至这些症状早于运动症状出现^[1]。内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,mPFC）调控许多脑的高级功能，是治疗精神疾病的脑内药物靶点^[2]。mPFC内的神经元以谷氨酸为神经递质的兴奋性锥体神经元为主，另有少部分γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）能抑制性中间神经元。mPFC接受来自中脑缝核的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine 或serotonin,5-HT）能神经纤维支配，并且表达多种5-HT 受体，如5-HT_1A、5-HT₂、5-HT₃和5-HT₇^[3]。有文献指出^[4]，在PD病人和PD模型动物脑内，5-HT_1A、5-HT₂A和5-HT₃亚型在缝核、海马结构和前额叶皮层的表达发生了改变，电生理研究结果发现黑质纹状体通路损毁大鼠mPFC锥体神经元对5-HT_1A、5-HT_2A/2C和5-HT₃受体刺激的反应性发生异常^[5-6]。这些结果表明mPFC和5-HT递质系统功能紊乱有可能是PD病程中出现非运动症状的病理生理学基础。

5-HT₇受体与多种生物功能有密切关系，如情绪调控、生物节律以及睡眠等，各项实验都显示大鼠的新皮层表达5-HT₇受体^[7]，我们前期的实验表明：5-HT₇受体参与了正常大鼠mPFC锥体神经元的电活动^[8]，然而，到目前为止，并没有在体电生理学研究大鼠单侧黑质-纹状体通路损毁后5-HT₇受体功能的变化。因此，本实验采用电生理技术，在体研究6- 羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）单侧损毁SNc 建立的PD模型大鼠mPFC锥体神经元电活动的变化，并观察PD模型大鼠mPFC锥体神经元对5-HT₇受体刺激的反应性改变。

实验动物：健康雄性Sprague-Dawley大鼠（体质量270~320 g），饲养在适宜环境，随意摄食和饮水，动物使用严格遵守国家实验动物管理和使用的相关规定。实验动物分成两组：正常组（n=69）和PD模型组（n=69）。

药物：地昔帕米、6-OHDA、阿朴吗啡和picrotoxinin均购自Sigma 公司（St.Louis，MO，美国），AS 19 和SB269970 购自Tocris 公司（Ellisville，MO，美国）。6-OHDA和阿朴吗啡溶于含0.02%抗坏血酸的生理盐水，地昔帕米和SB 269970 溶于生理盐水，AS 19 和picrotoxinin分别溶于含1%和5%二甲基亚砜的生理盐水中，所有药物均现配现用。

采用6-OHDA单侧毁损大鼠中脑SNc的方法制备PD动物模型，方法与前期实验相同^[6]，简而言之，动物用4%水合氯醛麻醉（400 mg/kg），头部固定于立体定位仪（SN-2N，Narishige，Tokyo，日本），5 min 内将6-OHDA（8 μg/4 μL）注射到SNc（立体定位：AP-5.0-5.3，L1.9-2.1，D7.1-7.3），给药速度为0.5 μL/min。在手术前30 min动物腹腔注射地昔帕米（25 mg/kg）以保护去甲肾上腺素纤维免受6-OHDA损伤。手术两周后，动物皮下注射阿朴吗啡（0.05 mg/kg），每5 min向对侧旋转次数超过20圈者，才被入选下一步实验。

6-OHDA 注射后第3 周，记录mPFC锥体神经元放电，方法同前期实验^[8]。mPFC锥体神经元细胞外放电波宽较长（>1 ms），放电形式为不规则放电基础上的爆发式放电。符合以上标准且基础自发放电频率能稳定维持2 min的神经元放电被纳入下一步实验。

体循环给药及局部给药方式方法同前期实验^[8]。简而言之，体循环给药即通过大鼠颈外静脉，每间隔90 s，给予系列剂量的AS 19溶液（40、80、160、320、640 μg/kg），最后给予SB 269970（200 μg/kg），观察神经元放电。部分神经元在系列给药后，用picrotoxinin（2 mg/kg）替代SB 269970；局部给药即采用双管玻璃微电极记录到神经元放电后，用给药电极给予AS 19溶液0.08 μg，然后再给予SB 269970（2 mg/kg），观察神经元放电变化。

组织学Nissl染色：电生理学记录完毕后，用玻璃微电极电泳滂胺天蓝标记最后1个记录位点（-20 μA，15 min）。大鼠过量麻醉、固定、取脑、冠状切片，Nissl染色以确定记录点位置。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）免疫组织化学染色：为观察6-OHDA注射后DA能神经元毁损的程度，对SNc/腹侧被盖区（ventral tegmental area,VTA）相应部位的脑片行TH免疫组织化学染色，对损毁侧与未损毁侧TH染色阳性细胞数进行比较。

在给药前，记录神经元的基础放电5 min。在给药后，单个神经元的放电变化超过基础放电的20%，即认为该神经元的电活动发生了显著改变。大鼠损毁侧与未损毁侧TH免疫阳性神经元数目的比较应用Student's t检验。给药后放电频率的变化采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。Post-hoc多重比较采用Dunnett's检验。所有数据均采用均数±标准误或基础放电率的百分比表示。应用SPSS16.0进行统计学分析，认为P<0.05为差异具有统计学意义。

SNc损毁的PD模型鼠皮下注射阿朴吗啡后向损毁侧的对侧旋转的次数均大于20圈/5 min。所有记录的mPFC的神经元都具有已有文献所描述的锥体神经元的典型电生理特征^[9]（图1A~C）。正常鼠和PD模型鼠所有电生理记录位点经组织学染色证实均位于mPFC内（图1D）。

图1(Fig.1)

图1 大鼠mPFC中的记录位点以及mPFC中锥体神经元的放电特征 Fig.1 Localization of the neurons recorded in the mPFC of rats and spontaneous firing activity ofmPFC pyramidal neurons. A: Extracellular recordings of representative mPFC pyramidal neuronsshowing the spontaneous firing activity; B: Action potential waveform; C: ISIHs showing the firingpatterns of the neurons; D: Photomicrograph of Cresyl Violet staining showing the recording site(arrow) in the mPFC marked with iontophoretically injected Pontamine Sky Blue.

观察6-OHDA损毁大鼠SNc 和VTA内TH着色神经元数目的改变，结果发现：损毁3周后，损毁侧SNc内的TH 阳性神经元完全消失（图2A~C），而且损毁侧VTA内的TH阳性神经元也减少了（41±2）%（n=12；P<0.001；配对t检验；图2A~C），对比VTA，SNc内的TH阳性神经元减少更为显著。

图2(Fig.2)

图2 SNc和VTA的TH免疫组织化学染色 Fig.2 TH immunohistochemical staining of the SNc and VTA. A, B: Photomicrographs of a representative section showingthe SNc and VTA dopaminergic neurons on the injected side (right) compared to non-injected side (left) in the6-OHDA-lesioned rat. Scale bar=400 μm; C: Histogram showing the percentage of TH-ir neurons loss in the SNc and VTAon the injected side of the lesioned rats (n=12). MTN: Medial terminal nucleus. *P<0.001 vs non-injected side.

正常鼠锥体神经元的放电频率为1.1±0.1 spikes/s（n=69，图3B），而PD模型大鼠锥体神经元的放电频率明显增加到2.1±0.2 spikes/s（n=69，P<0.001；独立样本t检验；图3B）。

图3(Fig.3)

图3 大鼠mPFC锥体神经元的放电频率 Fig.3 Firing rate of pyramidal neurons recorded in the mPFC. A: Frequency distribution offiring rates of the neurons in normal (n=69) and 6-OHDA-lesioned (n=69) rats; B: Comparison of the mean firing rate of the neurons. *P<0.001 vs normal rats.

对于正常大鼠，体循环给予公认的5-HT₇受体激动剂AS 19可引起锥体神经元电活动产生3种不同的反应。当给予累积剂量达到640 μg/kg的AS 19后，总共记录到得28个神经元当中，有15个（54%）神经元放电频率加快，5个神经元的放电频率降低（18%），还有8个神经元的频率没有发生改变（28%，图4A、B），但是综合考虑所有神经元的效应，发现系列静脉注射AS 19（40~640 μg/kg）引起锥体神经元放电频率剂量依赖性增加（n=28，F_5,162=2.71，P<0.05；方差分析，图4E）。当给药剂量达到160 μg/kg时，神经元的兴奋程度已明显高于基础放电，且差别具有统计学意义（n=28，P<0.05；Dunnett's 检验，图4E），累积给药640 μg/kg时，放电频率是基础放电频率的（158±21）%。AS19所引起的兴奋效应能够被200 μg/kg 特异性5-HT₇ 受体拮抗剂SB269970（200 μg/kg）反转，频率恢复到基础放电频率的（104±15）%（n=15，图4A、B）。此外，AS 19的抑制效应能被GABA_A受体拮抗剂picrotoxinin（2 mg/kg）反转，回到基础频率的（87±11）%（n=4，图5A）。

图4(Fig.4)

图4 大鼠静脉给予累积剂量的AS19对mPFC中锥体神经元的作用 Fig.4 Sytemic administration of AS 19 regulates firing rate of mPFC pyramidal neurons. A,B: Normal rats; C,D: Lesioned rats.Arrows indicate the time of administration of AS 19 or SB 269970; E: Dose-response curves showing the effects of the cumulativedoses of systemically administered AS 19 on the firing rate of the neurons in normal (n=28) and lesioned (n=26) rats. *P<0.05,**P<0.01 vs baseline firing rate.

图5(Fig.5)

图5 体循环给予AS 19对mPFC锥体神经元产生的抑制效应可被picrotoxinin反转 Fig.5 Effect of picrotoxinin on AS 19-induced inhibition of mPFC pyramidal neurons. A: Normal rat; B: Lesioned rat.

同样，体循环给予AS 19也能引起PD模型组大鼠锥体神经元3 种不同的反应。当给药累积剂量达到640 μg/kg时，26个神经元之中有14个兴奋（54%），7个抑制（27%），5个没有变化（19%）（图4C、D），考虑所有神经元的综合效应，相同剂量的AS19同样剂量依赖性地加快锥体神经元的放电频率（n=26，F_5,150=3.14，P<0.01，方差分析，图4E）。与正常鼠不同的是，当给药剂量达到640 μg/kg时，模型鼠神经元的兴奋效应才具有统计学意义，此时的放电频率是基础放电频率的149±21%（n=26，P<0.05，Dunnett's t检验，图4E）。静注200 μg/kg 的SB 269970同样可以反转AS 19的效应，频率恢复到基础放电的（110 ± 6）%（n=7，图4C、D）。然而，运用picrotoxinin（2 mg/kg）却不能完全反转AS 19诱导的抑制，只能回到基础放电的69±10%（n=4，图5B）。

为了进一步验证激活5-HT₇受体对mPFC锥体神经元电活动的影响，采用mPFC局部微量给药的方式，首先正常鼠局部微量注射生理盐水观察是否对神经元放电产生影响，结果发现100 nL 生理盐水能轻微降低锥体神经元的放电频率，是基础频率的（95±6）%（n=7，P>0.05，配对t test）。正常鼠局部给予AS 19 后（0.08 μg），18个神经元当中，有14个神经元兴奋，2个抑制，2个没有变化（图6A、B），总体反应是放电频率增加到基础放电的（272±55）%（n=18，P<0.01，配对t test，图6C），静脉注射200 μg/kg 的SB 269970 能够完全反转AS 19的兴奋效应（回到基础放电频率的（105±14）%，n=5，图6A~C）。而PD模型组局部给予相同剂量AS 19后，18个神经元当中只有5个神经元兴奋，5个抑制，8个未发生改变（图6D）。模型组大鼠对局部微量注射AS19 的总体反应是轻微兴奋（频率是基础放电频率的（109±12）%，n=18，P>0.05，配对t test，图6E），静脉注射200 μg/kg的SB 269970对神经元电活动没有影响（频率是基础放电频率的（117±18）%，n=4，图6D、E）。

图6(Fig.6)

图6 大鼠mPFC内局部注射AS19对锥体神经元的影响 Fig.6 Local administration of AS 19 regulates the firing rate of mPFC pyramidal neurons. A-C: Normal rats; D, E: Lesioned rats. Arrows indicate the time of administration of AS 19 or SB 269970. *P<0.01 vs baseline firing rate.

本研究结果表明：（1）体循环给予5-HT₇受体激动剂AS 19，累积剂量达到160 μg/kg 时，可增加正常鼠mPFC锥体神经元平均放电频率，局部微量注射0.08 μgAS 19也可兴奋锥体神经元；（2）对于PD模型鼠，静脉给药只有累积剂量达到640 μg/kg才能兴奋mPFC锥体神经元，局部给予相同剂量的AS 19并不改变神经元的放电频率；（3）体循环给予GABA_A 受体拮抗剂picrotoxinin能完全反转正常鼠AS 19的抑制效应，而模型鼠只能部分反转。

前额叶皮层受大量来自缝核的5-HT能纤维支配，分布有大量5-HT受体，目前发现5-HT受体共有14种亚型，5-HT₇受体是5-HT受体大家族成员之一。多项研究表明5-HT₇受体不仅在皮层有分布，在海马、丘脑、下丘脑、缝核以及杏仁核等脑区均有分布^[10]，5-HT₇受体被激活后和G蛋白偶联，从而促进cAMP形成，故5-HT₇受体激活能引起神经元的兴奋效应^[11]。AS 19对5-HT₇受体具有高度的亲和力，与5-HT_1A受体也能发生一定程度的结合^[12]。本研究中，在正常组大鼠，当AS 19累积体循环给药剂量达到640 μg/kg时，有54%的锥体神经元明显兴奋，另有18%的神经元被抑制，28%的神经元无变化，但是综合所有神经元的总体效应却是兴奋的，局部给药可兴奋78%的mPFC锥体神经元，而且5-HT₇受体的拮抗剂SB269970能完全反转这种兴奋效应，说明是5-HT₇受体介导了AS 19所引起的这种兴奋效应，由此我们认为无论是体循环还是局部给予AS 19引起的mPFC锥体神经元的兴奋效应很可能是因为AS 19直接激活了这些神经元上的5-HT₇受体，也就是说表现兴奋效应的锥体神经元上可能表达5-HT₇受体。

研究表明：激活5-HT₇受体会引起海马脑片CA1及CA3区锥体神经元兴奋，是因为该受体降低了慢后超极化电位，使超极化电位激活的I_h离子流增加^[13]，另有文献报道^[14]5-HT₇受体参与调控在体海马CA1及CA3区神经元电活动的易化，并参与去抑制海马切片CA3区癫痫样放电，这些研究结论都为本实验结果提供了有力的证据支持。那么，另有18%的锥体神经元应用相同剂量AS 19后呈现抑制效应，11%的神经元局部给药后放电频率减慢，而且SB 269979同样能反转这种抑制效应，表明这种抑制效应也是由5-HT₇受体所介导。但是，这个现象显然与前述的兴奋效应是相矛盾的。实验还观察到，GABA_A受体拮抗剂picrotoxinin也能反转AS 19引起的抑制效应，说明GABA_A受体与AS 19的抑制效应有关。尽管5-HT₇受体在mPFC锥体及中间神经元上的分布还不是十分明了，但体循环和局部给予AS 19产生的抑制效应很可能是因为支配锥体神经元的中间神经元上的5-HT₇受体被激活而引起。此外，额叶皮层上有50%~60%的锥体神经元以及20%~30%的中间神经元都有5-HT_1A受体表达，该受体能通过G蛋白与钾离子通道偶联，抑制腺苷酸环化酶活性，使膜电位发生超极化，使神经元出现抑制效应^[15]。因而由AS 19 引起的mPFC锥体神经元的抑制效应，除GABA中间神经元的作用外，可能有部分原因是因为这些锥体神经元上的5-HT_1A受体激活引起的。更重要的一点，5-HT₇受体拮抗剂SB 269970不仅能反转兴奋效应，而且也能反转抑制效应，表明这些效应都是由5-HT₇受体所介导，因为有文献已经证实SB 269970是5-HT₇受体最有效的拮抗剂，它和5-HT₇受体的结合能力是它和5-HT1，5-HT₂，5HT₃，5-HT₄，5-HT₅及5-HT₆等受体结合力的50~100倍^[16]。

PD模型大鼠体循环给予同样剂量的AS 19也能使mPFC锥体神经元产生3种不同的反应，54%的神经元兴奋，27%的神经元抑制，19%没有变化，综合评价所有神经元的反应，AS 19仍然是明显增加锥体神经元的放电频率，累积剂量达到640 μg/kg时，锥体神经元的放电频率是基础放电频率的1.46倍。但与正常大鼠相比，产生兴奋效应所需的累积剂量有明显不同，正常大鼠和PD模型大鼠神经元兴奋具有统计学意义所需AS19给药剂量分别为160 μg/kg和640 μg/kg。静脉给药引起PD 模型组大鼠神经元的兴奋和抑制效应都能被SB269970反转，表明这些效应都是由5-HT₇受体介导的，而picrotoxinin 只能部分反转AS 19 产生的抑制效应，并且局部应用AS 19并不改变mPFC锥体神经元的放电频率，但是对于正常组大鼠，相同剂量的AS 19能使mPFC锥体神经元的放电频率加快。有研究发现PD病人额叶皮层上谷氨酸羟化酶（1种GABA合成酶）活性大大降低^[17]。从当前的研究结果看，我们认为mPFC锥体和中间神经元上5-HT₇和GABA_A受体的表达下调和/或功能紊乱可能是PD模型大鼠mPFC锥体神经元对AS 19反应性降低的重要原因。

总之，本实验研究结果表明无论是体循环还是局部给予5-HT₇受体激动剂AS 19都能引起正常大鼠mPFC锥体神经元呈现兴奋、抑制和不变3种形式的反应，而总体反应是兴奋，而且AS 19 引起的抑制效应能被GABA_A 受体拮抗剂picrotoxinin反转。对PD模型大鼠而言，AS 19全身给药也能使mPFC锥体神经元产生3种反应，总体反应是兴奋，但产生兴奋所需的药物累积剂量明显比正常大鼠高，且抑制效应只能被picrotoxinin部分反转，局部应用AS 19不改变PD模型大鼠mPFC锥体神经元的放电。我们的实验结果说明AS 19以不同方式调控着mPFC锥体神经元的电活动，或者通过5-HT₇受体直接兴奋锥体神经元，或者通过激活GABA能中间神经元上表达的5-HT₇受体间接抑制这些神经元；黑质纹状体通路的退化导致mPFC锥体和中间神经元上5-HT₇和GABA_A受体出现功能紊乱和/或表达下调。这些结果为已知的5-HT₇受体对神经元的作用，以及5-HT₇受体参与PD病人的抑郁、焦虑和情绪紊乱等症状，提供了功能学和细胞学解释。