“二次打击学说”是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的重要发病机制。其中“第一次打击”指的是脂肪在肝细胞内的沉积，而“第二次打击”则通过氧化应激反应及炎症因子释放导致肝细胞炎症及坏死^[1]。氧化应激反应是指细胞功能失调导致的活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其代谢产物产生增多^[2]，其中ROS的生成包括线粒体及NOX途径^[3]。近来研究发现，炎症因子IL-1β可由炎症小体的激活产生^[4]。目前普遍认为，NAFLD的发生发展可能由血浆中的游离脂肪酸，尤其是饱和脂肪酸的过度堆积导致，其中棕榈酸（palmitic acid, PA）是饱和脂肪酸家族的重要成员之一。目前有研究表明，棕榈酸可通过损伤线粒体氧化呼吸链的正常功能^[5]，导致细胞发生氧化应激反应。另一方面，已有研究证实PA激活NOX4参与了肝细胞的胰岛素抵抗^[6]以及内皮细胞的损伤^[7]和功能失调^[8]，且通过促进IL-8释放导致肝细胞的炎症反应^[9]。而棕榈酸在肝细胞中的过度堆积在NAFLD的发展过程中能否通过激活NOX4导致氧化应激反应，又能否通过氧化应激反应激活炎症小体使肝细胞炎症因子IL-1β产生增加，目前尚缺乏相关研究探讨。本实验采用AML12小鼠正常肝细胞系观察棕榈酸对肝细胞氧化应激及炎症小体的影响，以探讨氧化应激及炎症小体对肝细胞脂肪变性的作用，并为NAFLD的治疗提供新思路。

AML12小鼠肝细胞系购于ATCC细胞库。DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），棕榈酸（PA，美国Sigma公司），N-乙酰半胱氨酸（NAC，美国Sigma公司），NOX4，NLRP3，ASC，caspase-1，单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），GADPH抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），DCFH-DA活性氧检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），MitoSOX线粒体超氧化物荧光指示剂（美国Introvigen公司），Mitotracker Deep Red线粒体荧光探针（美国Introvigen公司），TRITC标记荧光二抗（德国Earthox公司），ELISA试剂盒（RayBio Rat IL-1βELISA Kit）。

AML12细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO2饱和湿度培养箱常规培养。实验时，将处于对数生长期的细胞用0.25%含EDTA的胰酶消化并吹打成细胞悬液，根据实验需要铺板处理。

为了探讨不同浓度的PA对AML12细胞的影响，将AML12分为以下各浓度处理组：空白对照组组，0.15 mmol/L PA组，0.25 mmol/L PA组，0.4 mmol/L PA组。为了探讨活性氧对炎症小体的调节作用，将AML12细胞分为以下3组进行干预：空白对照组，PA组，PA+NAC组，其中PA为0.25 mmol/L，活性氧清除剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）为10 mmol/L^[10-11]，NAC预处理细胞1 h后，再加入PA处理24 h。

将细胞种于铺有10 mm×10 mm的盖玻片上，予药物处理后，弃去原有培养基，用4%多聚甲醛固定20 min后，予油红O染色30 min，苏木素染色5 min后蒸馏水清洗，甘油明胶封片，在光学显微镜下观察。

将细胞种植于96孔板中，使每孔细胞数量为10⁴，每组至少重复3个复孔，予药物刺激24 h后，吸去培养基，用PBS洗3次；将DCFH-DA以1:1000的比例稀释于DMEM中，以每孔200μL加入96孔板中，37℃孵育30 min；将探针吸去，用PBS洗3次；使用多功能酶标仪（SpectraMax M3）检测，使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，记录A值。

DMEM培养液稀释MitoSOX荧光探针储存液，使其工作浓度为5μmol/L。将细胞铺于6孔板中，用相应刺激处理细胞24 h后，吸去原有培养基，加入稀释好的MitoSOX荧光探针，37℃细胞培养箱内孵育20 min。将细胞消化成悬液，PBS洗涤3次，将细胞悬液加入流式管内，用流式细胞仪以激发波长510 nm，发射波长580 nm检测细胞荧光强度。

将细胞在10 mm×10 mm的盖玻片上黏附生长，分组刺激24 h后，移去原有培养基，用稀释5000倍的Mitotracker Deep Red荧光探针于37℃孵育20 min后，用4%多聚甲醛固定15 min再用0.5% TritonX-100孵育5 min。5% BSA封闭1h后用1%BSA稀释的NOX4抗体（1:50）孵育，4℃过夜。次日用PBS洗细胞3次，每次5 in，37℃孵育TRITC标记抗山羊二抗（1:100）2 h，DAPI染色后用抗荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察胞内定位。

将细胞铺于6孔板中，予相应药物刺激，刺激结束后吸去培养基，用PBS润洗3次后，每孔加入200μL蛋白抽提剂（每1 mL蛋白质裂解液中加10μL PMSF），用细胞刮将抽提剂均匀分布于板底部，冰上静置20 min后，收集裂解液并在4℃离心机中12 000 g离心30 min，取出上清液，用BCA法测定蛋白浓度，后按蛋白体积：5×loading buffer体积比4:1混合两者，在100℃沸水中煮5 min，以每孔30μg蛋白的量上样于12%SDS-PAGE进行电泳，电泳完毕后将蛋白转至PVDF膜，后用5%脱脂牛奶封闭1 h，然后根据所检测目的蛋白的相对分子质量将PVDF膜分别加入NLRP3抗体（1:500）、ASC抗体（1:500）、caspase-1抗体（1:1000）或GADPH抗体（1:5000）中，上述抗体用一抗稀释液稀释，于4℃孵育过夜。次日取出膜，用TBST清洗3次，每次10 min，再用相应HRP标记的二抗室温下孵育1.5 h，显影，记录结果。

将细胞种植于6孔板中，贴壁后予相应药物刺激，并保证每个孔的培养基体积一致，均为2 mL，刺激结束后吸取培养基，2000 r/min离心5 min，取出上清液，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-1β的浓度。

结果以Mean±SE表示，数据采用SPSS20.0软件进行分析，组间比较采用独立样本t检验，显著性检验标准为P＜0.05。

用不同浓度的棕榈酸刺激肝细胞24 h后，Western Blotting检测肝细胞中炎症小体各组分的表达，发现0.25 mmol/L的棕榈酸刺激肝细胞，可使NLRP3、ASC及caspase-1的表达最多（图 1），故下述实验选用0.25 mmol/L的PA进行。

图 1(Figure 1)

图 1 棕榈酸对肝细胞炎症小体的激活作用具有一定的浓度依赖性 Figure 1 Dose-dependent effect of PA in activating inflammasomes in hepatocytes.

将肝细胞进行油红O染色后，显微镜下观察，发现PA组的肝细胞胞质中可见大量明显的被染成红色的脂滴，而空白对照组未见脂滴沉积（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 棕榈酸导致脂滴在肝细胞中沉积 Figure 2 PA treatment induces lipid accumulation in hepatocytes (Original magnification:×200). A: Control group; B: PA treatment group.

用DCFH-DA探针标记后检测可知，PA处理后的肝细胞总ROS表达较空白对照组显著升高（12463.09±2.72 vs 6691.23±2.45，P=0.00），差异有统计学意义（图 3A），而用MitoSOX荧光探针检测亦发现PA处理后的肝细胞，其线粒体来源的ROS表达较空白对照组显著升高（64.98±0.94 vs 45.04±0.92，P=0.00），差异具有统计学意义（图 3B）。

图 3(Figure 3)

图 3 棕榈酸可导致细胞活性氧产生增加 Figure 3 PA induces ROS production in hepatocytes. A: Hepatocellular ROS expression detected by DCFH-DA probe; B: Mitochondrion-derived ROS detected by MitoSOX fluorescence probe; C: Expression and location of NOX4 and mitochondria observed by confocal microscopy. *P < 0.05 vs control group.

激光共聚焦结果表明，肝细胞线粒体及NOX4均定位于细胞质中，且线粒体与NOX4存在共定位的现象，而PA处理后的肝细胞NOX4荧光强度较空白对照组显著增加（图 3C）。进一步用Western Blotting检测提示，PA处理后的肝细胞，其蛋白中NOX4的表达较空白对照组增加（图 4A）。

图 4(Figure 4)

图 4 棕榈酸可诱导NOX4、炎症小体各组分及IL-1β表达 Figure 4 PA treatment increases expressions of NOX4, inflammasomes and IL-1β. A: NOX4 and inflammasomes expression in hepatocytes detected by western blotting; B: Expression of IL-1βdetected by ELISA. *P < 0.05 vs control group.

Western Blotting检测提示，经PA处理24 h后的小鼠肝细胞，其炎症小体各组分，包括NLRP3、ASC、pro-caspase-1及caspase-1的表达均较空白对照组增加（图 4A），且ELISA检测亦显示炎症小体激活的下游炎症因子IL-1β形成及分泌增加（1603.52±1.32 vs 2629.33±2.57，P=0.00，图 4B）。

DCFH-DA探针标记后检测可知，PA+NAC处理组的肝细胞总ROS表达较PA组显著降低（7782.15±2.87 vs 5445.6±1.17，P=0.00）（图 5A），而Western Blotting检测提示，PA+NAC组的肝细胞炎症小体各组分的的表达均较PA组显著减少（图 5B）。

图 5(Figure 5)

图 5 NAC可抑制棕榈酸导致的肝细胞活性氧产生及炎症小体激活 Figure 5 NAC inhibits the production of ROS and activation of inflammasomes induced by PA in hepatocytes. A: Hepatocellular ROS expression detected by DCFH-DA probe; B: Inflammasomes expression detected by Western blotting. *P < 0.05 vs control group; ^P < 0.05 vs PA treatment group.

棕榈酸作为一种长链饱和脂肪酸，是血脂是重要的组成成分，参与了NAFLD的发生^[12]。在正常情况下，线粒体可以通过脂肪酸β-氧化将细胞内过量的脂肪酸分解，并产生ATP供能，同时，电子呼吸链也会产生一定量的ROS ^[13-14]。而ROS的过量产生则会引起线粒体结构和功能的损伤，使电子呼吸链功能受损，进一步使细胞氧化应激反应增强，并导致脂肪酸分解功能障碍，使脂肪酸沉积于细胞质中^[15]。本研究我们亦发现，在PA的作用下，肝细胞中可见明显的脂肪颗粒沉积，且细胞总ROS及线粒体来源的ROS产生显著增加，证实了PA可引起线粒体氧化应激反应并导致肝细胞脂肪变性。

另一方面，NOX家族的激活也是细胞ROS产生的重要来源，其中，NOX4是NOX复合体中的活性组分，它在成纤维细胞^[16]及肾小球系膜细胞^[17]中的激活可以引起ROS的产生增加，且在乳腺癌细胞^[18]及血管内皮细胞^[19]中能调节线粒体DNA的复制及修复，并参与线粒体ROS的产生。在肝脏中，NOX4可参与四氯化碳诱导的肝星状细胞的增殖，促进肝脏纤维化^[20]。而我们在研究中发现，棕榈酸的沉积可引起肝细胞中NOX4表达增加，且NOX4定位于细胞质中，与线粒体存在共定位现象。说明NOX4亦参与了棕榈酸诱导的肝细胞氧化应激反应，且可能与线粒体共同参与调节肝细胞中ROS的产生。

NAFLD的发展过程中，由单纯性脂肪肝进展为NASH的过程需要炎症因子的参与。研究表明，棕榈酸可通过激活NF-κB及JNK/AP-1以促进IL-8的分泌^[21]，引起肝细胞的炎症反应，促进NASH的发生。近年来，关于炎症小体的研究逐渐成为热点，研究发现炎症小体参与了包括慢性丙型肝炎、肝脏缺血-再灌注损伤以及药物引起的肝损伤的病理过程^[22]。既往研究表明^[23]，棕榈酸在作用于内皮细胞时，可通过引起细胞氧化应激反应激活炎症小体。本实验发现，在肝细胞中，棕榈酸亦可引起炎症小体各组分，包括NLRP3、ASC及caspase-1的表达增加，并促进其下游的IL-1β分泌增加，且抗氧化剂NAC可有效抑制炎症小体的表达。提示棕榈酸在引起肝细胞脂肪变性的同时，可以通过激活炎症小体的途径导致肝细胞的炎症反应，且氧化应激反应与炎症小体的激活直接相关。

综合上述结果，我们可以认为，在肝细胞脂肪变性的发生过程中，饱和脂肪酸的过度沉积会作为“第一次打击”，引起下游的线粒体功能损伤并激活NOX4的表达，使细胞发生氧化应激反应，ROS产生增加，继而进一步抑制细胞生理功能，影响正常的脂肪代谢过程，加剧脂肪沉积。而另一方面，棕榈酸可以引起肝细胞炎症小体的激活及炎症因子的释放，导致细胞的炎症反应。上述过程均可作为NAFLD发生的“第二次打击”，促进NAFLD的发展，故寻求阻断上述病理过程的有效药物，是抑制NAFLD发生发展的重要方法和潜在新思路。