近年来，大量研究证实在许多恶性肿瘤中蛋白4.1的表达呈不同程度的下降或缺失，它的异常表达会导致肿瘤发生及肿瘤的恶化^[1-3]。蛋白4.1B是4.1家族（包括4.1R、4.1B、4.1N和4.1G）的重要成员^[4-5]，由EPB41L3基因编码。蛋白4.1B定位在细胞与细胞之间的接触位点，作为衔接蛋白连接细胞质膜与细胞骨架或者胞质效应分子，介导细胞骨架相关的细胞运动和粘附；调节细胞生长、分化、上皮样结构的建立^[6]。4.1B发挥了“细胞骨架连接蛋白”对肌动蛋白应力纤维的调节作用，从而抑制细胞的运动性发挥抑癌作用^[7]；在多种肿瘤细胞中，蛋白4.1B的表达对于细胞增殖调控、细胞黏附及信号转导均有重要意义^[8-9]。蛋白4.1B可能是人类癌症的一个重要的预后指标，也可能是一个潜在的抗肿瘤治疗的靶点。

恶性黑色素瘤（malignant melanoma, MM）又称为恶黑，发病率占皮肤恶性肿瘤的第3位，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3%~5%，其恶性度高、转移早，预后差，死亡率高^[10-11]。在本研究中，以MEF细胞为阳性对照，利用PCR技术扩增蛋白4.1家族，经过筛选得出：在核酸及蛋白水平，4.1B在小鼠黑色素瘤细胞系B16、B16-F10细胞均呈现缺失表达。研究结果表明EPB41L3可能是肿瘤抑制基因，但其在肿瘤发生发展过程中的功能仍不完全清楚^[12-13]。本研究中通过构建真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3，将EPB41L3基因导入B16、B16-F10细胞，并成功使其表达蛋白4.1B，进一步验证了蛋白4.1B在小鼠黑色素瘤细胞系中的肿瘤抑制作用。

野生型C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）以及4.1B敲除的MEF细胞（MEF 4.1B-/-）由美国纽约血液中心安秀丽教授惠赠，小鼠黑色素瘤细胞系B16和B16-F10购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。MEF、B16、B16-F10细胞均用含10%胎牛血清的DMEM培养基，分别于37℃，5% CO2的培养箱中培养，根据细胞生长情况，每2~3 d用含EDTA的胰酶消化MEF、B16细胞并传代，用不含EDTA的胰酶消化B16-F10细胞并传代，传代至对数生长期做相关细胞实验。

兔抗鼠4.1R、4.1G、4.1N、4.1B多克隆抗体由美国纽约血液中心安秀丽教授惠赠；HRP-羊抗兔IgG购买于武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；兔抗鼠EGFP单克隆抗体由美国血液中心安秀丽教授惠赠；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）购于美国Gibco公司；Trizol试剂、PrimeSTAR^TM HS（Premix）、DNA Maker、XhoⅠ、BamHⅠ内切酶和T₄连接酶购于TaKaRa公司；UltraSYBR Mixture购于北京康为世纪生物科技有限公司；Revertaid first strand cDNA synthesis kit购于Fermentas公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。基因测序由金唯智公司完成。

根据GeneBank上所提供的小鼠EPB41、EPB41L3、EPB41L1、EPB41L2及内参β-actin的mRNA序列，采用Primer Premier 5软件设计EPB41、EPB41L3、EPB41L1、EPB41L2及内参β-actin各自的特异性PCR引物（表 1）。pEGFP-N1-EPB41L3真核表达载体引物设计后应用BLAST软件进行在线筛查对比，以消除潜在的同源干扰，上游引物（引入XhoⅠ位点）：5'-AAACTCGAGATGACGACCGAATCAGGATCAGACTCAGAATCGAAGC-3'；下游引物（引入BamHⅠ位点）：5'-AAAGGATCCCGATCCTCTCCGTCCTCTGGTGTGATT-3（'划线部分为酶切位点，前面为保护碱基）。以EPB41L3基因序列为模板，根据荧光定量PCR引物设计原则，设计EPB41L3特异性的引物序列（表 2）。

表 1(Table 1)

表 1 4.1蛋白家族PCR引物序列 Table 1 Primer sequences for amplification of the 4.1 protein family members Gene Sequence of primers (5'-3') EPB41 Forward: ATGACAACAGAGAAGAGTTTAGTGGCTGAAGC Reverse: CTCCTCAGAGATCTCTGTCTCCTGGTGGA EPB41L2 Forward: ATGACTACTGAAGTTGGCTCTGCATCTGAAGTG Reverse: TTATTCTTCTCCTTCCTCCGCCAACTCTG EPB41L1 Forward: ATGACAACAGAGACAGGTCCCGATTCTGA Reverse: TCAGGATTCCTGTGGCTTCTTGTCTC EPB41L3 Forward: ATGACGACCGAATCAGGATCAGACTCAG Reverse: TCAATCCTCTCCGTCCTCTGGTGTGATT β-actin Forward: GCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTG Reverse: CGGACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGATCC

表 1 4.1蛋白家族PCR引物序列 Table 1 Primer sequences for amplification of the 4.1 protein family members

表 2(Table 2)

表 2 EPB41L3的qPCR引物序列 Table 2 Gene-specific primers used for quantitative real-time PCR of EPB41L3 Gene Sequence of primers (5'-3') EPB41L3 Forward: TGCGAACATCTGAACCTGCT Reverse: CCTTAGCAGGGTCCAACCAG GAPDH Forward: AGCTTGTCATCAACGGGAAG Reverse: TTTGATGTTAGTGGGGTCTCG

表 2 EPB41L3的qPCR引物序列 Table 2 Gene-specific primers used for quantitative real-time PCR of EPB41L3

待细胞生长至状态良好，TRIzol法提取MEF、MEF 4.1B-/-、B16、B16-F10细胞基因组RNA，Nanodrop 2000测得RNA浓度及纯度，以不大于1μg的RNA利用反转录试剂盒合成cDNA。以反转录产物为模板进行PCR反应，反应体系50μL：cDNA 2μL，上、下游引物各2μL，高保真酶Premix 25μL，ddH₂O 19 uL。PCR反应条件：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃3 min，共30个循环；72℃10 min。扩增后取PCR产物5 uL于1%琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶图像分析系统下观察并拍照。

培养MEF、B16、B16-F10细胞，当细胞铺满瓶底时，胰酶消化收集细胞，1000 r/min，5 min离心收集细胞，并用PBS清洗3遍。加入200μL裂解液和2μL PMSF，冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min，15 min，取上清。用BCA法酶标仪570 nm测蛋白浓度，调整蛋白浓度使其一致，加入2×Loading buffer，水浴煮沸5 min。细胞总蛋白经10% SDS-PAGE分离后，湿转法转膜到NC膜。用含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭2 h，TBST冲洗3次，10 min/次。分别加入兔抗鼠4.1R、4.1N、4.1G和4.1B多克隆抗体（1:100），4℃孵育过夜，TBST冲洗3次，10 min/次。加入HRP-羊抗兔lgG（1:4000），37℃水平摇床孵育1 h，TBST冲洗3次，10 min/次。ECL试剂盒显色发光，Azure c600-多功能分子成像系统采集图像。

以GAPDH为内参，使用荧光定量PCR Mix进行real time PCR，反应体系20μL：PCR Mix 10μL，ddH₂O6.4μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板为2μL。反应条件为：95℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40个循环；溶解曲线，60℃到95℃梯度升温溶解。实验数据采用△△Ct法统计分析。

将真核表达载体pEGFP-N1与EPB41L3基因纯化产物分别经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切和胶回收，利用T4连接酶进行连接，将EPB41L3基因导入pEGFP-N1表达载体中，经转化到DH5α宿主菌后涂布于LB平板，挑取单菌落并提取质粒进行酶切鉴定，再经过DNA测序进一步确认。验证正确后再进行大量扩增，保存重组质粒，命名为pEGFP-N1-EPB41L3。

当黑色素瘤细胞系B16、B16-F10细胞成长状态良好时，消化处理细胞并用血球计数板计数，将5×10⁵个细胞重悬于1 mL DMEM培养液中，转移至6孔细胞培养板，培养24 h左右，待单层细胞生长融合度达到70%~90%时可进行转染。细胞实验分组：转染试剂空白对照组（Control）、pEGFP-N1组以及pEGFP-N1-EPB41L3实验组，瞬时转染24 h后，荧光显微镜观察。Western blot检测4.1B的表达，EGFP（1:2000），二抗（1:6000）。

收集上述各实验组细胞，B16-F10细胞以8×10³/孔，B16细胞以6×10³/孔接种于96孔板，每孔培养液总量为200μL，于37℃5% CO₂培养箱中培养，分别在24、48、72、96 h换成无血清培养基，每孔加入20μL5 mg/mL的MTT孵育4 h后终止培养，弃上清，每孔加入150μL DMSO，将培养板置于酶标板，振荡10 min，然后570 nm处检测各孔吸光度。增殖率=（实验组-对照组）/对照组。

计数数据以均数±标准差表示，采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，两组间采用student's T test比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

以MEF细胞的cDNA为模板进行PCR，EPB41、EPB41L3、EPB41L1、EPB41L2基因均有目的条带，说明在MEF细胞中，蛋白4.1家族核酸水平均正常表达，这与文献报道相符，因此MEF作为阳性对照是可信的。以黑色素瘤细胞系B16和B16-F10的cDNA为模板进行PCR，核酸水平验证蛋白4.1家族的表达（图 1A）；以总蛋白为模板采用Western blot的方法验证蛋白4.1家族在蛋白水平的表达情况（图 1B）。结果提示：在核酸和蛋白水平，蛋白4.1B在B16和B16-F10中均表达缺失。

图 1(Figure 1)

图 1 蛋白4.1家族成员在小鼠黑色素瘤细胞中的表达筛选 Figure 1 Expression of protein 4.1 family members in melanoma cells. A: mRNA expression of 4.1 family members in MEF, B16, and B16-F10 cells detected by real-time PCR. M: DNA marker (DL5000); Lanes 1, 4, 7, 10: Expression of EPB41, EPB41L2, EPB41L1, and EPB41L3 mRNA in MEF cells, respectively; Lanes 2, 5, 8, 11: Expressions of EPB41, EPB41L2, EPB41L1, and EPB41L3 mRNA in B16 cells, respectively; Lanes 3, 6, 9, 12: Expression of EPB41, EPB41L2, EPB41L1, and EPB41L3 mRNA in B16-F10 cells. ***P < 0.001; B: Expressions of 4.1 protein family members detected by Western blotting. 1: MEF cells; 2: B16 cells; 3: B16-F10 cells.

提取MEF细胞总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增小鼠EPB41L3基因。利用T₄连接酶将经XhoⅠ、BamHⅠ双酶切的EPB41L3片段和pEGFP-N1载体进行连接，随后连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取经Kana筛选的菌落进行培养，提取质粒，质粒产物经XhoⅠ单酶切，XhoⅠ、BamHⅠ双酶切，并进行1%琼脂糖凝胶电泳后可见约7.3kb线性化pEGFP-N1-EPB41L3重组质粒、4.7 kb线性化pEGFP-N1载体和2.6 kb的EPB41L3条带（图 2），测序结果与Genebank中的EPB41L3序列完全一致。结果表明，重组载体pEGFP-N1-EPB41L3构建成功。

图 2(Figure 2)

图 2 MEF细胞中EPB41L3外显子图谱（A）及pEGFP-N1-EPB41L3重组质粒XhoⅠ和BamHⅠ酶切鉴定结果（B） Figure 2 Exon composition of EPB41L3 isoforms in MEF cells (A) and identification of pEGFP-N1-EPB41L3 plasmid by XhoⅠand BamHⅠdigestion (B).

将pEGFP-N1-EPB41L3瞬时转染小鼠黑色素瘤细胞B16、B16-F10细胞24 h后，在荧光显微镜下观察到B16和B16-F10细胞发出清晰的绿色荧光信号（图 3），荧光显微镜分析结果说明，pEGFP-N1-EPB41L3载体在黑色素瘤B16、B16-F10细胞中表达了EGFP-4.1B融合蛋白。pEGFP-N1-EPB41L3载体转染导入B16和B16-F10细胞24 h后，Real-time PCR分析结果进一步说明，pEGFP-N1-EPB41L3载体在B16、B16-F10细胞中表达了EGFP-4.1B融合蛋白（图 4）；Western blot检测结果显示，与control和pEGFP-N1细胞相比，pEGFP-N1-EPB41L3转染的B16、B16-F10细胞表达了蛋白4.1B（图 5）。

图 3(Figure 3)

图 3 pEGFP-N1-EPB41L3重组质粒在B16-F10、B16细胞中表达EGFP-4.1B融合蛋白 Figure 3 Expression of EGFP-4.1B fusion protein in B16 and B16-F10 cells transfected with pEGFP-N1-EPB41L3 recombinant plasmid.

图 4(Figure 4)

图 4 Real-time PCR分析重组质粒pEGFP-N1-EPB41L3转染后B16-F10、B16细胞EPB41L3基因mRNA水平的表达 Figure 4 EPB41L3 mRNA expression level analyzed by real-time PCR in B16 and B16-F10 cells transfected with pEGFP-N1-EPB41L3 recombinant plasmid. ***P < 0.001 pEGFP-N1-EPB41L3 vs pEGFP-N1.

图 5(Figure 5)

图 5 Western Blot分析重组质粒pEGFP-N1-EPB41L3转染后B16-F10、B16细胞4.1B蛋白水平的表达 Figure 5 Expressions of 4.1B protein detected by Western blotting in B16-F10 cells (A) and B16 cells (B) transfected with pEGFP-N1-EPB41L3 recombinant plasmid. 1: Nontransfected cells; 2: Cells transfected with pEGFP-N1; 3: Cells transfected with pEGFP-N1-EPB41L3.

抑制B16、B16-F10细胞体外增殖MTT实验结果显示，蛋白4.1B的表达对黑色素瘤细胞B16、B16-F10的增殖均有抑制作用。在第2，3天，外源蛋白4.1B的表达对B16-F10细胞增殖有显著性抑制作用；B16细胞的MTT结果显示从第1天起蛋白4.1B的表达就对B16细胞增殖起抑制作用（图 6）。

图 6(Figure 6)

图 6 EGFP-4.1B蛋白抑制B16-F10（A）、B16（B）细胞的体外增殖 Figure 6 Proliferation of B16-F10 (A, 8×103cells) and B16 cells (B, 6×103cells) transiently transfected with EGFP-4.1B recombinant plasmid. The data are presented as absorbance at 570 nm. ***P < 0.001 pEGFP-N1-EPB41L3 vs pEGFP-N1 or Control.

蛋白4.1超家族不仅在维持细胞形态、连接细胞表面糖蛋白和细胞骨架方面起重要作用^[14]，在肿瘤发生、发展、转移中也起到重要的调控作用。蛋白4.1B与血影蛋白-肌动蛋白^[15]、14-3-3蛋白家族^[16]、整合素^[17-1]、肺癌肿瘤抑制因子1（tumor suppressor in lung cancer-1, TSLC-1）^{[3, 19]}等分子相互作用发挥肿瘤抑制因子的作用。近年研究表明在多种肿瘤细胞中，蛋白4.1B的表达对于细胞增殖^[6]、运动性^[20]、黏附^[9]、信号转导^[6]、上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）^[21-22]等都具有重要意义。蛋白4.1B在多种组织中都有表达，相关研究证实蛋白4.1B在多种恶性肿瘤或良性肿瘤如非小细胞肺癌^[2]、前列腺癌^[23]、肾细胞癌^[24]、卵巢癌^[25]等中出现表达缺失或下调。本课题组选取小鼠黑色素瘤细胞B16、黑色素瘤高转移细胞B16-F10作为研究对象，以MEF细胞为阳性对照，首次发现，蛋白4.1B在小鼠黑色素瘤细胞系B16、B16-F10细胞中显著性表达缺失。推测蛋白4.1B可能在黑色素瘤细胞的恶化过程中具有一定作用。

我们选择了pEGFP-N1真核表达系统，成功构建了pEGFP-N1-EPB41L3重组质粒，瞬时转染小鼠黑色素细胞B16、B16-F10，成功获得了表达蛋白4.1B的细胞系。MTT法检测细胞增殖显示外源蛋白4.1B抑制黑色素瘤细胞的增殖，依据相关文献推测蛋白4.1B可能通过以下两种通路抑制细胞生长：蛋白4.1B的非保守区（U2）定位在细胞质膜，通过依次激活Src、Rac1、MLK3和JNK，从而减少细胞周期蛋白A(cyclin A)的表达，降低Rb蛋白过磷酸化^[26]；蛋白4.1B与它的结合配偶体PRMT5相互作用，通过甲基化组蛋白H4抑制细胞周期蛋白E1启动子活化间接抑制细胞生长^[27]。前期实验结果显示B16、B16-F10细胞表达外源蛋白4.1B后，在显微镜下可观察到细胞形态逐渐变圆，随着培养时间延长，细胞逐渐脱离，表现出细胞凋亡特征。有研究证实蛋白4.1B可通过TLR4或gab-1激活JNK，启动凋亡蛋白酶1介导的凋亡^[2]或依赖凋亡蛋白酶8介导细胞凋亡^[29]。推测蛋白4.1B在抑制黑色素细胞增殖和促进其凋亡过程中发挥着重要作用，蛋白4.1B的缺失表达可能是导致黑色素瘤恶性度高、易发生转移的原因之一。

在多种肿瘤进展的早期阶段，蛋白4.1B表达量的不同程度下降会启动肿瘤生成。本研究结果表明，4.1B蛋白表达缺失的黑色素瘤细胞B16和B16-F10重新表达4.1B蛋白后，其细胞增殖作用被显著性抑制，这进一步证实EPB41L3基因编码的蛋白4.1B可能是肿瘤进展中的负调控分子。因此，通过使肿瘤细胞表达4.1B蛋白可能成为新的肿瘤治疗方式，通过DNA甲基转移酶抑制剂抑制EPB41L3基因启动子去甲基化，通过腺病毒、慢病毒、质粒使缺失EPB41L3基因的肿瘤细胞重新表达蛋白4.1B有望成为新的肿瘤治疗策略。