Nanog是含同源结构域的转录因子，在胚胎干细胞干性维持和自我更新中起作用，在干细胞中表达，而在分化成熟细胞中表达缺失^[1]；近年的研究发现，Nanog可促进肿瘤的转移。一方面，肝癌^[2]，结直肠癌^[3]、乳腺癌^[4-5]等癌组织Nanog的表达升高并与死亡率正相关；另一方面，过表达Nanog的结直肠癌细胞，迁移和侵袭能力增强^[3]。有关Nanog促进肿瘤转移的机制，已有一些研究，如：Nanog可降低卵巢癌细胞中E-cadherin和FoxJ1的表达，促进卵巢癌转移^[6]；Nanog可促进转化生长因子家族蛋白NODAL的表达，激活上皮间质转化，从而促进肝癌细胞转移^[7]；Nanog促进乳腺癌转移的机制与其促进PDGFRa的表达有关^[8]；但Nanog促进癌细胞转移的机制目前还无定论，因此，深入研究Nanog促进癌细胞转移的机制仍很有必要。

Nanog作为转录因子，有多个靶基因。Nanog靶基因包括细胞周期蛋白D1（cyclin D1）^{[4, 9]}、生长分化因子3（GDF3）^[10]、粘着斑激酶^[11]和胎肝激酶-1 ^[12]等激酶。激酶的活性异常与肿瘤转移的关系非常密切，如蛋白激酶C（PKC）^[13-14]等，但Nanog促进乳腺癌转移是否与其对激酶的调节有关，并无相关研究。

Ezrin由Vil2基因编码，是ERM（Ezrin-Radixin-Moesin）家族的成员，其表达升高和第567位苏氨酸（ezrin^T567）等位点氨基酸的磷酸化与乳腺癌转移有关^[15-16]。Bruce等^[17]报道，ezrin表达升高与乳腺癌的不良预后有关，敲低乳腺癌细胞ezrin可抑制乳腺癌细胞的侵袭能力^[18]。雌激素通过使ezrin^T567磷酸化活化ezrin，促进乳腺癌细胞的迁移^[19]。已经发现有几种激酶能磷酸化ezrin^T567，包括蛋白激酶A ^[20]、Rho ^[21]、Akt2 ^[22]、PKC ^[23-24]包括PKC亚型PKCθ^[25]、PKCα和PKCι^[26]，它们在不同的情形下使ezrin^T567的磷酸化。在乳腺癌中，PKCɛ的表达水平可作为乳腺癌患者不良预后的指标^[27]，但PKCɛ是否可使ezrin^T567的磷酸化没有相关报道。

我们研究了Nanog对PKCɛ表达的影响及PKCɛ对ezrin^T567磷酸化的影响。我们的研究结果提示，Nanog可上调PKCɛ的表达，后者可使ezrin^T567磷酸化，这可能是Nanog促进肿瘤转移的一个新机制。这一研究结果加深了对Nanog促进乳腺癌转移机制的了解。

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7和人胚肾上皮细胞293T购自中科院上海细胞库。MCF-7和293T细胞用DMEM（Gibco，美国）培养，MDA-MB-231细胞用L-15培养基（Hyclon，美国）培养，所有基础培养基均添加10%胎牛血清（Gibco，美国），100µg/mL青霉素和100µg/mL链霉素，细胞培养于5% CO2的37℃培养箱。

L15、DMEM细胞培养液及胰酶购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Transwell小室、Matrigel基质胶、PVDF膜购自美国BD公司；兔抗人Nanog单克隆抗体、兔抗人pEzrinT567单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；鼠抗人ezrin单克隆抗体购自美国Sigma公司；鼠抗人β-actin、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；LipofectamineTM3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Protein A/G琼脂糖树脂购自美国Life公司。

免疫印迹实验用于检测蛋白表达。将细胞消化后接种到12孔板，1×10⁴个细胞每孔。用预冷的PBS洗涤细胞2次，吸净液体。将细胞放置在冰上，加入1 mL预冷的PBS，细胞刮刀刮下细胞，离心收集。向每管细胞中加入100μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 g，4℃离心10 min，取上清，BCA法测定总蛋白浓度。蛋白样品上样前加入上样缓冲液，100℃金属浴加热5 min，12 000 g离心3 min，直接用于蛋白免疫印迹。SDSPAGE分离蛋白，转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶摇床上室温封闭1 h，加入相关蛋白的一抗（Nanog抗体，1: 500；ezrin抗体，1:4000；pEzrin^T567抗体，1:1000；β-actin抗体，1:3000），4℃孵育过夜；二抗羊抗兔/鼠（1:3000）室温孵育1 h，ECL显影。

MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞按1.2×10⁵/mL密度接种于6孔板中，过夜后分别用Lip3000将siRNA转染入MCF-7和MDA-MB-231细胞，37℃孵箱中培养60 h，收集细胞裂解液，进行Western blotting。转染过程按Lipofectamine3000说明书进行。

小分子干扰RNAsi-Nanog、si-Ezrin和si-PKCε由上海吉玛公司合成，其序列分别是：siRNA-Nanog，Negative control：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUT T-3'，si-Nanog1：5'-CCAGACCUGGAACAAUUCAT T-3'，si-Nanog2：5'-CCAUGGAUUUAUUCCUAAAT T-3'，si-Nanog3：5'-GGGUUAAGCUGUAACAUACT T-3'。si-PKCɛnegative control：5'-UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3'，si-PKCɛ：5'-UCAAUGACAAGG CCUUCCgg-3'。具体转染方法按Lipofectamine3000的说明书进行。

Transwell实验用于检测细胞的迁移和侵袭能力。取5µL Matrigel基质胶溶于95μL DMEM基础培养基，加入到Transwell小室中，在37℃孵箱静置1 h，小心吸除小室中未凝液体（迁移实验不需要经过此步），24孔板内加入750µL基培/孔，将小室放在孔内（确保无气泡），向小室内加入500µL基培，放入37℃孵箱30 min；用于Transwell实验的癌细胞为对数生长期细胞，消化离心，用无血清培养基稀释细胞至3×10⁵/mL，每个小室中加入500µL细胞悬液，下室每孔加入含10%胎牛血清的培养基750µL，MDAMB-231培养12 h，MCF-7细胞培养48 h，用棉签擦去小室上层未侵袭的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色30 min。显微镜下拍摄，在400×视野下取上、下、左、右、中5个固定的视野拍照，计算这5个视野内的细胞总数。

制备细胞爬片，将传代消化下来的细胞计数，稀释成密度为1×10⁴个细胞/mL的细胞悬液，混匀后取400μL/孔细胞悬液于8孔载玻片中，放入37℃孵箱中培养；24 h待细胞长开后，用1×PBS洗细胞3次，加入4%多聚甲醛，室温固定30 min；去除多聚甲醛并用30 mmoL甘氨酸终止固定；用0.5%的Triton-X透化细胞5 min；用1×PBS洗2次，每次5 min；用5%牛奶和2%BSA（用PBS稀释）室温封闭1 h；加一抗（用封闭液稀释一抗），按照相应比例加入Nanog抗体（1:100），Ezrin抗体（1:200），pEzrin T567抗体（1:100），4℃过夜；洗脱一抗（用0.05% Triton-X在摇床上洗3次，每次5 min）；加二抗（将二抗羊抗兔/鼠，1:100，用封闭液稀释），常温孵育1 h。洗脱二抗（用0.05% Triton-X在摇床上洗3次，每次5 min）；用DAPI染核5 min；用1×PBS洗掉多余的DAPI；滴加抗免疫荧光衰减剂，盖盖玻片，用透明无色指甲油封片；激光共聚焦显微镜下观察拍照。

将细胞接种到10 cm培养皿中，待细胞长满后弃培养基，用预冷的1×PBS洗3次，用预冷的PBS洗涤细胞2次，吸净液体。将细胞放置在冰上，加入600 mL预冷的RIPA裂解液，细胞刮刀刮下细胞，收集到1.5 mL离心管中，冰上裂解30 min，12 000 g 4℃离心10 min，取上清，BCA法测定总蛋白浓度，蛋白量约400µg。取10%上清作为Input，将剩下的蛋白裂解液分成两部分，一部分加入5µL兔IgG抗体，另一部分加入5µL PKCε抗体，4℃旋转过夜。次日，取60µL Protein A/G琼脂糖树脂，用ddH₂O洗3次，将树脂均分成两管，分别将孵育了兔IgG抗体和PKCε抗体的蛋白裂解液加入含树脂的管内，4℃旋转2 h，离心，弃上清，用裂解液清洗沉淀3次，离心弃上清，将上清吸净，加入2×Loading buffer，100℃金属浴加热5 min，12 000 g 4℃离心3 min，进行Western blotting。

不同实验组的数据以均数±标准差表示，统计分析和柱状图制作均用Gaphpad prism5.0，不同组之间分析用非配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

我们先用免疫印迹检测了3条Nanog特异的siRNA敲低乳腺癌细胞系MCF-7 Nanog表达的效果，发现第3条si-Nanog3的敲除效果最明显。我们选取Nanog siRNA3用于后续实验。用Nanog siRNA3敲低乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中的Nanog，癌细胞的迁移与侵袭能力减弱（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 敲低Nanog降低MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭 Figure 1 Nanog knockdown decreased the migration and invasion of MDA-MB-231 and MCF-7 cells. A: Nanog protein expression in MCF-7 transfected with each of the 3 different siRNAsequences targeting Nanog; B: Nanog knockdown decreased the migration and invasion ability of MDA-MB-231 and MCF-7 cells (Original magnification:×400). ***P < 0.05 MDA-MB-231 vs control group; **P < 0.05 MCF-7 vs control group.

由于PKCɛ的表达水平可作为乳腺癌患者不良预后的指标^[27]，且又有研究报道^[9-12]Nanog可促进多个激酶的表达促进肿瘤转移，因此我们观察了敲低Nanog对PKCɛ的表达的影响。结果表明，用Nanog siRNA3敲低乳腺癌细胞系MCF-7中的Nanog，PKCε的蛋白表达量也相应下降（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 敲低Nanog降低MCF-7细胞中的PKCε蛋白表达 Figure 2 Nanog knockdown decreased the expression of PKCεprotein in MCF-7 cells.

由于PKCε是否是ezrin^T567磷酸化的上游激酶并无相关研究，我们研究了PKCε是否是使ezrin^T567磷酸化的另一个PKC亚型。研究结果显示，用Nanog siRNA3敲低乳腺癌细胞系MCF-7中的Nanog，免疫印迹实验结果表明，ezrin^T567磷酸化水平相应降低（图 3A）。敲低MCF-7和MDA-MB231细胞Nanog，免疫荧光染色实验检测发现，ezrin^T567磷酸化水平相应降低（图 3B）。

图 3(Figure 3)

图 3 敲低乳腺癌细胞中的Nanog降低ezrinT567磷酸化水平 Figure 3 Nanog knockdown in breast cancer cells decreased the phosphorylation level of ezrinT567. A: Western blotting for detecting the phosphorylation level of ezrinT567 in MCF-7 cells with Nanog knockdown; B: Immunofluorescent images showing decreased phosphorylation level of ezrinT567 in MDA-MB-231 and MCF-7 cells with Nanog knockdown (Original magnification:×200).

为进一步研究PKCε是否可磷酸化ezrin^T567，用PKCε特异的siRNA敲低乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的PKCε，然后免疫印迹检测ezrin^T567酸化水平，结果表明，敲低PKCε，MDA-MB-231细胞中ezrin^T567的磷酸化水平也同时下降（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 敲低PKCε降低MDA-MB-231细胞中的ezrinT567的磷酸化水平 Figure 4 PKCεknockdown decreased the phosphorylation level of ezrinT567 in MDA-MB-231 cells.

为研究PKCε使ezrin^T567磷酸化是否需要PKCε和ezrin的相互作用，我们用MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞裂解液和抗PKCε抗体作免疫共沉淀实验，抗PKCε抗体的免疫沉淀复合物中，可检出ezrin（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 ezrin与PKCε免疫共沉淀 Figure 5 Co-immunocipitation of ezrin and PKCεwith anti-PKCε.

我们的研究发现，敲低Nanog，在乳腺癌细胞的侵袭能力下降的同时，PKCɛ蛋白表达和ezrin^T567磷酸化水平相应下降，敲低PKCε降低ezrin^T567磷酸化水平，PKCε与ezrin可免疫共沉淀。

我们用siRNA敲低乳腺癌细胞系MCF-7和DA-MB-231中的Nanog，发现乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力减弱，我们的研究结果和Lu等^[8]报告的结果一致，Lu等在MCF-7细胞过表达Nanog，可以促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移；这一研究结果也与Nanog促进其它癌细胞迁移的研究结果一致，如肝癌^[7]，卵巢癌^[6]等。

促进肿瘤转移的因素如雌激素^[19]和内皮细胞生长因子^[28]等促进癌细胞的侵袭与ezrin^T567磷酸化水平升高有关，因此，我们假设Nanog促进乳腺癌转移的机制与Nanog调节ezrin^T567磷酸化水平有关。为验证这一假设，我们用siRNA敲低乳腺癌细胞中Nanog后，检测了ezrin^T567的磷酸化水平，结果发现Nanog降低后，ezrin^T567的磷酸化水平确实相应的降低了（图 3）。这一结果验证了我们的假设。除了ezrin^T567磷酸化与癌细胞转移有关外，第477位酪氨酸（ezrin^Y477）磷酸化^[29]也与肿瘤转移有关。本研究没有检测ezrin^Y477磷酸化水平变化的情况，今后可进一步研究。

可使ezrin^T567的磷酸化的激酶有多种，包括蛋白激酶A ^[21]、Rho ^[21]、Akt2 ^[22]、PKC ^[23-24]包括PKC亚型PKCθ^[25]、PKCα和PKCι^[26]，它们在不同的情形下使ezrin^T567的磷酸化。这自然使我们推测Nanog调节ezrin^T567的磷酸化是由于Nanog调节这些激酶表达所致，而且，以前的研究也表明，Nanog的确可调节一些激酶的表达，如粘着斑激酶^[11]和胎肝激酶-1^[12]等。我们注意到，在乳腺癌中，PKCɛ的表达水平可作为乳腺癌患者不良预后的指标^[27]，因此我们选PKCɛ作为观察对象，看Nanog是否可调节PKCɛ的表达。我们发现，用siRNA敲低MCF-7细胞中的Nanog，细胞中的PKCε蛋白表达量也降低，这是一个新的发现，提示Nanog可调节PKCε表达。我们的研究没有观察敲低Nanog对其它激酶，尤其PKC家族的其它相关亚型表达的影响，因此不能排除Nanog也可能通过影响其它激酶的表达，影响ezrin^T567磷酸化。

对于PKCɛ是否可以使ezrin^T567磷酸化，以前并无研究。我们的研究表明，敲低Nanog，可降低MCF-7和MDA-MB-231细胞ezrin^T567磷酸化，提示ezrin^T567是PKCɛ的底物；用siRNA敲低乳腺癌细胞系MDAMB-231中的PKCε，ezrin^T567的磷酸化水平下降，这些结果进一步证明，PKCε可使ezrin^T567磷酸化；我们用免疫共沉淀实验检测到PKCε能与ezrin直接相互作用，这可能是PKCε使ezrin^T567的磷酸化的分子基础。

我们的这一研究还存在一些不足，如我们没有通过过表达Nanog观察Nanog对PKCε表达的影响；由于敲除Nanog后PKCε蛋白的表达水平降低，我们只能推测Nanog是通过影响PKCε的转录所致，这一推测主要是基于Nanog是转录因子。但这一推测还需更多实验证明，因为也不能排除Nanog通过影响PKCε蛋白的稳定性调节PKCε的表达水平。此外，敲低Nanog降低ezrin^T567的磷酸化也可能还存在其他机制，还有待进一步研究。

综上所述，我们的研究发现，敲低Nanog，乳腺癌细胞的侵袭能力下降的同时，PKCɛ蛋白表达和ezrin^T567磷酸化水平相应降低，提示Nanog通过促进PKCε表达使ezrin^T567磷酸化，后者促进乳腺癌细胞的侵袭能力。Nanog-PKCε-ezrin^T567轴可能是Nanog促进乳腺癌转移的一个新途径。