血友病A(Hemophilia A, HA)是一种由于凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因缺陷所致的严重的出血性疾病，是临床上最常见的X连锁隐性遗传病，在男性中的发病率约为1/5000 ^[1]。HA患者的出血程度与其体内的血浆凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)水平有关。FⅧ制剂替代治疗是目前HA患者的主要疗法。随着替代治疗的普及，部分患者产生FⅧ抑制物，成为替代治疗过程中最严重的并发症^[2-5]。产生抑制物的患者，止血非常困难，不但增加了治疗成本，还导致患者的高致残率，甚至对HA患者尤其是重型HA患者的生命构成威胁。

FⅧ抑制物又称FⅧ抗体，是HA患者在替代治疗过程中产生的一种严重的免疫反应。当HA患者体内形成抑制物时，会阻碍输注凝血因子有效止血。FⅧ抑制物滴度越高，止血越因难，出血越严重。FⅧ抑制物的形成是遗传因素与诸多环境因素相互作用的结果^[6-9]。环境因素包括初次使用FⅧ制剂的年龄、输注FⅧ制剂的类型、剂量、频率以及给药模式等与治疗相关的因素。我国HA患者抑制物发生率远低于欧美等发达国家的21%~33% ^[10]。闫振宇等^[11]在265例HA患者中的抑制物检出率为8.3%，患者临床用药剂量、用药频率、用药类型、检测频率低、检测水平和方法的差异等均有可能是导致抑制物检出率偏低的原因。随着治疗手段的增多、检测方法的改进以及临床医师对抑制物认识的提高，近年来FⅧ抑制物的发生率有增高趋势。FⅧ抑制物的检测对于HA患者的临床用药指导以及对获得性血友病的实验室诊断具有重要的意义。

目前，开展FⅧ抑制物检测的医学实验室较少。Bethesda方法及其以此为基础衍生的各种方法仍是最常用的FⅧ抑制物检测方法，但因操作繁琐，影响因素多，其室内重复性与室间可比性差，各实验室间缺乏统一的操作规程。本文通过对Bethesda方法改进，将Owren's Veronal Buffer代替咪唑缓冲液，将经Owren's Veronal Buffer缓冲的正常混合血浆代替未经缓冲的正常混合血浆；对Nijmegen方法进行改进，将咪唑缓冲液改为乏Ⅷ因子血浆，用Owren's Veronal Buffer代替咪唑缓冲液对正常混合血浆进行缓冲，将待测血浆进行58 ℃水浴90 min预处理，然后3500 r/min离心10 min。结合空白对照法，即将Owren's Veronal Buffer缓冲液改为去离子水以去除缓冲体系，以此探讨FⅧ抑制物检测过程中的各种影响因素，并进一步评价两种改良方法在FⅧ抑制物检测中的临床应用。

在我院就诊的部分男性HA患者257例，正常对照血浆来自20例健康志愿者。分别采集外周静脉血，以枸橼酸钠(109 mmol/L)1:9抗凝，3500 r/min离心10 min，制备乏血小板血浆。

所用仪器为日本Sysmex CA1500全自动凝血分析仪。乏Ⅷ因子血浆、标准人类血浆及Owren's Veronal Buffer(pH7.35±0.1)等相关试剂均购自SIEMENS公司。FⅧ抑制物滴度≥0.60 BU/mL判为阳性结果。

将收集的对照组血浆混合后再与Owren's Veronal Buffer缓冲液4:1混合，作为正常混合血浆，分装后置于-40 ℃保存备用。

在96孔板内分别加入80 μL未稀释原血浆以及经Owren's Veronal Buffer缓冲液1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512和1:1024等不同的稀释度病例血浆各80 μL，再加入80 μL正常混合血浆作为待测血浆；80 μL正常混合血浆与80 μL Owren's Veronal Buffer缓冲液1:1混合作为对照血浆，封板后置37 ℃温育2 h。以一期法分别测定待测血浆和对照血浆的FⅧ:C活性，以对照血浆的F Ⅷ:C活性水平为参照建立标准曲线。计算待测血浆的相对剩余FⅧ:C活性，相对剩余FⅧ:C活性应介于30%~70%之间，以接近50%为准。待测血浆FⅧ:C活性降至50%时定义为1个Bethesda单位(BU)，再乘以待测血浆的稀释倍数，得到待测血浆FⅧ抑制的最终结果。与经典的Bethesda方法相比，不同之处在于将Owren's Veronal Buffer代替咪唑缓冲液，将经Owren's Veronal Buffer缓冲的正常混合血浆代替未经缓冲的正常混合血浆。

将Owren's Veronal Buffer缓冲液改为乏Ⅷ因子血浆，对待测血浆进行58 ℃水浴条件下90 min预处理，然后3500 r/min离心10 min，以去除其它凝血因子的干扰。其它步骤同改良Bethesda方法。与经典的Nijmegen方法相比，不同之处在于将Owren's Veronal Buffer代替咪唑缓冲液对正常混合血浆进行缓冲，将待测血浆进行58 ℃水浴条件下90 min预处理。

将Owren's Veronal Buffer缓冲液改为去离子水以去除缓冲体系，其它步骤同改良Bethesda方法

不同方法检测抑制物滴度水平之间采用t检验，不同方法的阳性率比较采用χ²检验，数据分析采用SPSS19.0统计软件，P < 0.05为差异有统计学意义。

经统计学卡方检验，改良Nijmegen方法阳性率较空白法具有显著统计学意义(P=0.001)，改良Bethesda与改良Nijmegen(P=0.105)和改良Bethesda与空白法组间阳性率均无统计学差异(P=0.079，表 1)

表 1(Table 1)

表 1 3种抑制物检测方法的阳性率分析 Table 1 Analysis of FVIII inhibitors positive rates in three detection methods Inhibitors result Modified bethesda（n=257） Modified nijmegen（n=257） Blank assay（n=257） Positive 204 219 186 Negative 53 38 71 Positive rates (%) 79.38 85.21* 72.37* *P < 0.001 between modified Nijmegen assay and blank assay.

表 1 3种抑制物检测方法的阳性率分析 Table 1 Analysis of FVIII inhibitors positive rates in three detection methods

改良Bethesda方法、改良Nijmegen方法以及空白法的抑制物滴度水平分别为：15.51±37.82 BU/mL、16.83±40.24 BU/mL和12.07±29.54 BU/mL。改良Bethesda方法与改良Nijmegen方法之间相关系数为0.996(P < 0.001)，两组抑制物滴度水平间有显著的统计学差异(P < 0.001)；改良Bethesda方法与空白法之间相关系数为0.994(P < 0.001)，两组抑制物滴度水平间有显著的统计学差异(P < 0.001)；改良Nijmegen方法与空白法之间相关系数为0.994(P < 0.001)，两组抑制物滴度水平间有显著的统计学差异(P < 0.001，表 2)

表 2(Table 2)

表 2 3种检测方法的抑制物滴度水平分析 Table 2 Analysis of FVIII inhibitor titers detected by the 3 methods Statistics parameters Modified Bethesda vs Modified Nijmegen Modified Bethesda vs Blank assay Modified Nijmegen vs Blank assay Correlation test（r/P） 0.996/0.000 0.994/0.000 0.994/0.000 P 0.000 0.000 0.000

表 2 3种检测方法的抑制物滴度水平分析 Table 2 Analysis of FVIII inhibitor titers detected by the 3 methods

FⅧ抑制物检测的方法学进展较慢，目前检测FⅧ抑制物的方法有多种，如ELISA、Bethesda、Nijmegen、Bethesda发光法、免疫荧光法等。目前，以Nijmegen为基础的各种改良方法在临床实验室应用广泛，但各实验室的操作规程存在差异，室内重复性及室间可比性较差。

Bethesda法和Nijmegen法通过测定残余FⅧ:C活性，间接检测FⅧ抑制物。Bethesda法^[12]以病例血浆与正常混合血浆1:1混合作为待测血浆，以正常混合血浆与pH7.4的咪唑缓冲液1:1混合作为对照血浆，经过37 ℃温育2 h后检测残余FⅧ:C活性，以待测血浆中的残余FⅧ:C活性相对对照血浆下降50%为1个BU单位，计算出FⅧ抑制物的滴度。Bethesda方法受到诸多因素的影响：抗原抗体反应过程中的温度、反应体系的pH值、反应时间等等。另外，对照血浆与待测的病例血浆中其它凝血因子水平的差异，也是影响检测结果稳定性、灵敏度及特异性的主要因素。

Nijmegen法^[13]在Bethesda方法的基础上进行了改进，以咪唑和盐酸滴定正常混合血浆至pH 7.4，保证温育过程中pH值的稳定，以乏FⅧ血浆替代咪唑缓冲液与咪唑缓冲滴定后的正常混合血浆组成对照血浆，对需要稀释测定的病例血浆也用乏FⅧ血浆稀释，与待测血浆保持相似的反应环境，减少了检测误差提高了准确率。王健琨等对Nijmegen方法进行改进，对待测样本首先进行58 ℃水浴90 min预处理，然后再进行其它步骤的操作，提高了FⅧ抑制物检测的特异性，但其灵敏度显著降低^[14]。

其它方法均存在特异性差、操作繁琐、检测成本高等诸多问题^{[6, 15-17]}。

Bethesda法和Nijmegen法均是通过测定残余FⅧ: C活性，也即是测定抗原抗体在37 ℃水浴反应后体系的活化部分凝血活酶时间来间接实现FⅧ抑制物的检测。在这一过程中，所有影响抗原抗体反应和活化部分凝血活酶时间检测的因素，如：抗原抗体反应过程中的温度、反应体系的pH值是否稳定、反应时间是否足够、反应体系中内源性凝血因子和共同途径凝血因子的活性水平等等。王健琨^[14]等通过改良Nijmegen方法，对待测血浆进行58 ℃水浴条件下90 min预处理，其FⅧ抑制物检出率较Nijmegen方法特异性更高。范连凯等^[18]通过改良Bethesda方法，使用乏FⅧ血浆替代缓冲液，使得FⅧ抑制物检出率较Nijmegen方法有所提高，但无统计学差异。另外，对不同方法学的FⅧ抑制物检测滴度水平进行统计学t检验，以评价不同检测方法的灵敏度，未见报道。

本研究中3种方法的阳性率分析表明，与改良Bethesda方法相比，虽然没有缓冲体系的空白法因缺少缓冲体系的保护，绝大多数凝血因子易失活，但对于F Ⅷ抑制物的阳性率并无显著影响，因此，反应体系中其它各凝血因子水平的一致性则是影响抑制物阳性率的主要因素(表 1)。对3种检测方法的抑制物滴度水平统计学t检验表明，稳定的缓冲体系和反应体系中其它各凝血因子水平的一致性均是FⅧ抑制物检测的显著影响因素(P值均为0.000，表 2)。

本研究所中的改良Nijmegen方法除了有缓冲体系，将待测标本经58 ℃水浴条件下90min预处理，并且同时使用乏FⅧ血浆替代缓冲液，除了使得反应体系中凝血因子受到保护外，进一步消除了反应体系中其它凝血因子活性水平不一致的影响，虽然阳性检出率较改良Bethesda方法无明显提高(P=0.105)，但经统计学t检验，其灵敏度更高，更有助于对低滴度FⅧ抑制物的检出(P=0.000)。

综上所述，反应体系内其它凝血因子水平的一致性，是FⅧ抑制物检测过程中的最主要影响因素，而稳定的pH体系也是影响检测结果稳定性、灵敏度及特异性不可忽视的因素。我们认为，本研究所采用的改良Nijmegen法，将待测标本经58 ℃水浴条件下90 min预处理，在反应体系中加入缓冲体系，并使用乏FⅧ血浆，不但提供了保护凝血因子的缓冲体系，同时也消除了其它凝血因子水平的不一致性，其结果更灵敏，更稳定可靠，更适用于HA患者FⅧ抑制物的临床实验室检测，并为HA患者的临床治疗模式提供更可靠的实验室依据。