多发伤（MI）是急诊外科的常见病种之一，由于MI导致生命征不平稳而直接影响生命^[1-2]，故MI的病理生理学改变应得到充分的认识。研究表明^[2]，免疫功能失调在MI早期即发挥重要角色，如CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Treg）表达含量增多。此外，MI可导致包含血小板（PLT）^[3]及D二聚体（D-D）^[4]在内的凝血功能障碍，从而形成恶性循环。同样作为Treg的一种，CD8⁺CD28^-T细胞在MI起到何种作用，与凝血功能关系如何？目前尚缺少研究。以此为创新点，本研究观察了MI患者不同时间点CD8⁺CD28^-Treg及其细胞因子的变化，并发现其与血小板及D-D呈显著相关性。

以2011年1月~2015年1月期间我科收治的MI患者作为观察对象，入选条件如下：同一外力因素导致2个及以上系统受损，具体诊断参照1994年年首届全国多发伤学术会议标准^[5]；伤前无合并肿瘤或免疫性疾病；近期无使用激素、免疫抑制剂或生物制剂^[6]。共入选26例MI患者，其中男性23例，女性3例，年龄17~58岁，中位年龄45岁；车祸伤19例，殴打伤5例，高处坠落伤2例；胸腹联合伤13例，头胸及四肢伤11例，骨折合并内脏损伤9例。受伤至到诊时间差为20 min~1.5 h。以同期就诊的31例单纯外伤（SI）患者为阳性对照组，男26例，女5例，年龄20~63岁，中位年龄42岁；以同期到院查体的35名健康体检者为阴性对照组，男28例，女7例，年龄17~70岁，平均年龄47岁。以上3组的性别比例及年龄均无统计学差异（P>0.05）。

在MI患者被送到急诊外科、伤后24 h、伤后48 h及伤后72 h共4个时间点分别采集其静脉血5 mL，使用免疫磁珠法分离出CD8⁺CD28^-T细胞。使用固定穿透剂对胞内细胞因子TGF-β1及IL-10进行染色，使用BD公司生产的流式细胞仪的双激光光源，以CD8及CD28进行设门，进行CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10的检测，每管获取细胞数1000个。运用FACSDIVA软件分析对3者的百分含量进行^[7]。单纯外伤组患者在急诊就诊即刻采集静脉血。健康组在清晨空腹时采集静脉血，均按照上述方法检测。

比较上述3组研究对象血小板计数及D-D含量，且MI组患者分别在伤后24、48及72 h均进行血小板及D-D含量比较^[8]。

定量资料采用均数±标准差表示，采用方差分析LSD法进行3组间的两两比较，指标间的相关性分析采用Pearson参数法。使用统计软件包SPSS 17.0处理数据，当P < 0.05认为差异有统计学意义。

与健康组比较，单纯外伤及MI组患者CD8 ⁺ CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10均升高，但单纯外伤组与健康组上述3者无统计学差异，但MI组3者显著高于另外两组（均为P < 0.05）。单纯外伤及MI组患者血小板及D二聚体均显著高于健康组，3组间的两两差异均具有显著性（均为P < 0.05，表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 3组CD8+CD28-T细胞、血小板及D二聚体含量比较 Table 1 Percentages of CD8+CD28-T lymphocytes, platelets and D-dimer in the 3 groups (Mean±SD) Groups n CD8+CD28-T cells (%) TGF-β1 (%) IL-10 (%) PLT (G/L) D-Dimer (mg/L) MI 26 5.28±3.19*# 4.36±2.07*# 4.79±2.18*# 431.48±226.19*# 8.29±6.12*# SI 31 3.02±1.37 2.75±1.24 2.91±1.37 316.64±159.27# 4.13±3.04# Control 35 2.74±1.23 2.49±1.13 2.63±1.25 223.81±104.93* 1.48±0.93* F 2.893 2.571 2.704 19.823 4.012 P 0.013 0.032 0.021 0.000 0.003 MI: Multiple injury group; SI: Single injury group; PLT: Platelet. *P < 0.05 vs single injury group; #P < 0.05 vs healthy group.

表 1 3组CD8+CD28-T细胞、血小板及D二聚体含量比较 Table 1 Percentages of CD8+CD28-T lymphocytes, platelets and D-dimer in the 3 groups (Mean±SD)

有1例MI患者在伤后第15小时死亡（失血性休克），1例在伤后39 h死亡（脑疝），2例在伤后48~72 h死亡（1例为脓毒症，另1例为呼吸衰竭）。伤后48 h，MI患者CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10均显著高于伤后24 h（均为P < 0.05）；但伤后72 h上述3项指标均较伤后48 h及24 h显著下降（均为P < 0.05）。伤后24、48及72 h血小板及D二聚体均呈下降趋势，任意两个时间点的变化均具有统计学差异（均为P < 0.05）。

MI患者急诊首次检测CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10这3者含量与血小板及D二聚体两者均呈显著正相关性（所得相关系数r均大于0.70，P均小于0.05），其中相关性最强为CD8 ⁺CD28^-T细胞与血小板（^P=0.000）。

免疫功能改变在疾病的发生发展过程中的重要作用已经得到各个专业领域学者的重视，包括内科疾病及外伤等外科疾病。研究表明^[9-10]，在创伤早期即可引起免疫功能的异常，导致免疫细胞池的重新分布，这当中不同功能的免疫细胞如T细胞会募集到相应的损受损部位，从而对外伤导致的病理生理学产生影响，最终导致不同的疾病结局。T细胞可分为CD4+辅助性（Th）及CD8⁺杀伤性（Tc）两大亚群，严重多发伤后患者免疫功能受到明显抑制，且CD4⁺/CD8⁺亚群的比值可以作为严重多发伤患者预后的一个评价指标，这初步说明此两群细胞的重要性^[11-12]。Th包括了CD4⁺CD25⁺Treg及分泌白介素17的Th17细胞等，其中CD4⁺CD25⁺Treg与严重多发伤患者免疫功能抑制密切相关，它们能抑制性调节CD4⁺和CD8⁺T细胞的活化与增殖，达到免疫的负调节作用^[13]。而Tc包括了CD8⁺CD28⁺及CD8⁺CD28^-两大群T细胞，后者由于具有免疫增强及免疫抑制双重功能，因此被归属到Treg亚群^[14]。近年研究表明^[15]，缺乏CD28⁺表达的CD8⁺CD28^-细胞同CD4⁺CD25⁺Tregs一样，具有免疫抑制活性，也是Tregs中的一个重群体，它们既能抑制T细胞增殖又能抑制其细胞毒性。因此，CD8⁺CD28^-与CD4⁺CD25⁺Tregs可能协同加重严重创伤患者的免疫抑制。Treg细胞有一个共同特点，即分泌细胞因子TGF-β1及IL-10从而实现免疫调节，故此两种细胞因子往往可反映细胞功能而常被检测^[16]。

表 2(Table 2)

表 2 MI患者不同时间点CD8+CD28-T细胞、血小板及D二聚体含量变化 Table 2 Percentages of CD8+CD28-T lymphocytes, platelets and D-dimer at different time points following MI (Mean±SD) Time points after injuries n CD8+CD28-T cells (%) TGF-β1 (%) IL-10 (%) PLT (G/L) D-Dimer (mg/L) 24h 25 5.41±3.27# 4.59±2.28# 5.03±2.39# 441.27±238.22# 9.27±6.93# 48h 24 6.92±4.39* 5.43±2.42* 6.21±3.78* 394.32±215.93* 6.24±5.07* 72h 22 4.18±2.78*# 3.01±1.25*# 4.03±2.54*# 305.18±173.32*# 4.13±2.47*# F -3.383 -3.274 -3.012 14.297 4.734 P 0.011 0.023 0.031 0.001 0.006 PLT: Platelets. *P < 0.05 vs 12 h after injury; #P < 0.05 vs 24 h after injury.

表 2 MI患者不同时间点CD8+CD28-T细胞、血小板及D二聚体含量变化 Table 2 Percentages of CD8+CD28-T lymphocytes, platelets and D-dimer at different time points following MI (Mean±SD)

表 3(Table 3)

表 3 CD8+CD28-T细胞与血小板及D二聚体的相关性分析 Table 3 Correlation analysis of CD8+CD28- T lymphocytes with platelets and D-dimer in patients with MI Indexes CD8+CD28-T cells TGF-β1 IL-10 r P r P r P PLT 0.864 0.000 0.791 0.003 0.816 0.000 D-Dimer 0.764 0.012 0.779 0.016 0.725 0.023 PLT: Platelets.

表 3 CD8+CD28-T细胞与血小板及D二聚体的相关性分析 Table 3 Correlation analysis of CD8+CD28- T lymphocytes with platelets and D-dimer in patients with MI

有学者^[2]在MI患者伤后1、3、5、8 d用流式细胞仪检测各组患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg，发现伤后5 d Treg细胞比率开始升高，从而认为CD4⁺CD25⁺Treg在严重创伤后的免疫抑制中扮演着重要的角色，Treg细胞比率的变化有助于评估患者的预后及判断并发脓毒症的危险度。还有学者发现^[17-18]，严重多发伤患者早期即有CD4⁺CD25⁺Treg比例的显著升高，且认为检测CD4 ⁺ CD25⁺Treg的水平对于评估严重多发伤患者的细胞免疫状态，预测继发感染均有很大的帮助。此外，凝血功能的异常被认为是MI的另一个重要病理生理学改变。有研究发现^[19]，血小板数（PC）/白细胞数（WBC）比值（PC/WBC）在MI患者伤后第1、3、7天均呈现显著性变化，提示PC/WBC比值可作为多发伤患者的预后判断指标。还有学者发现^[20]，MI患者出现死亡组的DD水平显著高于生存组，且其并发多器官功能障碍综合征（MODS）几率同样显著高于非并发MODS组。以上研究凸显Treg在MI病情进展的重要作用，也提示凝血功能障碍在MI的作用。但CD8⁺CD28^-Treg与MI的关系如何，其与凝血功能障碍关系如何？目前尚未见探讨，这对于深化MI的免疫学特征研究是不利的。

本研究发现，MI组患者CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10均显著高于单纯外伤组及健康组；但后两组之间无统计学差异，这初步说明CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β 1及IL-10这3者的同步升高对于MI而言具有特异性，对于单纯外伤而言无特异性，间接提示3者与受伤程度及生命体征是否平稳相关。在凝血功能方面，本研究发现，单纯外伤及多发伤组患者血小板及D二聚体均显著高于健康组，3组间的两两差异均具有显著性，这说明不论是否属于MI，伤后均有不同程度的凝血功能异常，表现为高凝状态，但这种状态没有特异性，同时说明，血小板及D-D的特异性不如CD8⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10这3者。在动态演变方面，伤后48 h MI患者CD8 ⁺CD28^-T细胞、TGF-β1及IL-10均显著高于伤后24 h，但伤后72 h上述3项指标均较伤后48 h及24 h显著下降，提示伤后48 h可能是CD8⁺CD28^-T细胞含量及其分泌TGF-β1及IL-10的高峰期，此含量随后显著下降，可能是免疫抑制过度需求增加导致消耗增多所致。在凝血功能指标的演变方面，伤后24、48及72 h血小板及D二聚体均呈下降趋势，任意两个时间点的变化均具有统计学差异，提示伤后由于大部分患者出现失血，甚至失血性休克，导致血小板消耗过多，体内处于低凝状态，故血小板及D-D降低。相关性分析显示，CD8+CD28-T细胞、TGF-β1及IL-10这3者与血小板及D二聚体两者均呈显著正相关性，这进一步提示了，在创伤早期，CD8⁺CD28^-T细胞及其细胞因子升高与高凝状态是平行的，其机制是保护体内的过度失血状态，对机体可能是有利的因素。

本研究认为，早期升高、伤后72 h回落是多发伤患者CD8⁺CD28^-T细胞及其细胞因子的变化趋势，且3者与凝血功能受损及出血倾向有关。本研究的不足包括观察例数较少，观察周期较短，将在后续的研究加以改进。