热疗用于肿瘤治疗由来已久，随着磁热疗技术的发展，热疗再次成为肿瘤治疗的研究热点。目前关于热疗基因水平的作用机制研究较多，有文献报道热处理可致S期阻滞及此期氧化碱基、无碱基位点、碱基脱氨基等DNA损伤形成^[1]。近期较多关于热损伤后DNA双链断裂（DSB）形成的文献发表^[2-6]，但现有报道大多提示DSB主要发生在G1、G2期，S期无或极少产生DSB，这与S期热敏感现象矛盾。为探讨S期细胞热敏感原因，我们猜想S期细胞受热后发生碱基损伤并使损伤修复蛋白变性失活，当含碱基损伤的DNA继续指导复制时可延迟形成DSB，最终导致细胞死亡。因此本研究应用S期同步化细胞进行热处理后动态观察DSB形成，同时监测细胞周期、细胞死亡率以探讨S期热敏感原因，结合DNA复制、损伤修复蛋白结果分析DSB形成机制。

非小细胞肺癌H1299细胞由美国北卡罗来纳教堂山分校病理学和实验医学实验室惠赠，并用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM完全培养基置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、D-Hanks液与双抗均购自美国Gibco，细胞周期检测试剂盒（KGA214）和RNase A购自凯基生物公司，锐博EdU检测试剂盒（C10310）、碧云天细胞核蛋白抽提试剂盒（P0027）均购自广州安邦生物科技有限公司，多聚甲醛（美国Sigma），低熔点琼脂糖（美国Amresco），正常熔点琼脂糖（西班牙Biowest），p-ATM（phospho S1981，英国abcam）抗体、RAD18抗体（美国CST）。

细胞培养箱（美国Thermo Fisher），流式细胞仪（guava easyCyte HT，美国Millipore），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS IX51），图像采集系统（日本OLYMPUS DP Controller），化学发光成像系统（中国Tanon）。

取对数生长期细胞换为45 ℃预热的培养基后迅速放入45 ℃ 5% CO₂孵箱加热1 h（研究的预实验—平板克隆形成实验结果提示克隆形成率为50%左右的加热条件为45 ℃×1 h），热处理后换为37 ℃预热的培养基并根据实验目的放回37 ℃孵箱内继续培养0、2.5、5、7.5、10、12.5 h用于后续实验。

将各组细胞用胰酶消化、离心收集细胞沉淀后参照周期检测试剂盒说明书操作：PBS清洗2遍再加入适量70%乙醇于4 ℃过夜固定；次日弃掉固定液并用PBS清洗，重悬细胞使浓度为1×10⁵/mL，加入适量的RNase储备液37 ℃水浴30 min去除RNA后再加入PI染液常温避光染色30 min，上机检测，最后用Modifit软件分析检测结果。每组各3瓶细胞，实验重复3次。

将96孔板中对数生长期细胞进行实验处理后参照EdU试剂盒说明书操作：每孔加入50 μL 50 μmoL的EdU培养基孵育2 h后用4%多聚甲醛固定，再每孔加入50 μL 1×Apollo染色反应液避光染色EdU，1×Hoechst33342反应液复染DNA。最后每孔随机选5个视野用荧光显微镜拍照、Image-Pro Plus6.0软件计数，EdU阳性率=复染细胞数/总细胞数。每组各设3个复孔。

将对数生长期细胞用D-Hanks液清洗两遍后加入无血清DMEM进行饥饿培养，饥饿时间参考Akihisa Takahashi报道的28 h^[6]，然后恢复全培继续培养，每2 h随机取3皿细胞（汇合度 < 100%）采用流式细胞术检测周期并将检测结果绘制成周期图，将周期图中S期比例最高的时间点作为H1299细胞S期的同步条件。

参照Velichko，A.K.的实验步骤^[2]并稍作调整：（1）铺胶：取150 μL正常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于毛玻璃载玻片，置4 ℃固化，分别取30 μL各组细胞悬液与70 μL低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第1层凝胶上，4 ℃固化；（2）裂解和电泳：凝胶板置于新鲜配制的中性裂解液并于4 ℃裂解2 h；TE溶液漂洗去掉多余盐分，于4 ℃电泳液（TBE溶液，pH：8.2~8.5）中解旋30 min后电泳（25 V 30 min）；（3）染色和观察：PI染色后荧光显微镜（×20）下观察并每个样本随机摄取3个视野。CASP软件分析各样本结果，Olive尾距（OTM）作为分析指标。实验重复3次。

按细胞核蛋白提取试剂盒操作步骤提取DNA结合蛋白并用BCA法测定蛋白浓度，各组细胞分别取50 μg蛋白用10% SDS-PAGE凝胶进行分离。完成电泳后利用半干转法将蛋自质转印至PVDF膜，将膜以脱脂奶粉封闭后转入p-ATM、RAD18蛋白抗体稀释液中4 ℃孵育过夜, 然后用过氧化物酶偶联的二抗孵育2 h，最后经充分清洗后以ECL化学发光法显色曝光并采集图片。

将各组细胞悬液浓度调整为5×10⁵/mL，分别吸出0.9 mL均匀细胞液，加0.1 mL 0.4%的台盼蓝混匀染色，3 min内计数，细胞变蓝者为死细胞，每瓶细胞计数3次，取均值。细胞死亡率=死细胞总数（/活细胞总数/死细胞总数）×100%。

实验数据用SPSS 20.0统计软件分析，两组间比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异具有统计学意义。

热处理后动态观察加热组及对照组细胞的周期分布（图 1）可看出：H1299细胞热损伤后随着37 ℃正常孵育时间延长，S期细胞逐渐增多并于7.5 h左右比例达到最高：（51.63±0.27）%；之后S期比例逐渐减小，提示阻滞解除。未加热组S期比例变化微小。正常孵育5、7.5、10 h加热组S期比例与对照组差异有统计学意义（P < 0.01）。

图 1(Figure 1)

图 1 H1299细胞热损伤（45 ℃×1 h）后加热组与对照组的S期比例对比 Figure 1 Proportion of S-phase cells in heat exposure group(45 ℃×1 h) and control group. Data are presented as Mean±SD from 3 independent experiments (**P < 0.01, ***P < 0.001).

为了验证45 ℃热损伤1 h后细胞复制是否停止，我们进行了EdU掺入实验。其结果（图 2）与图 1比较分析可知EdU阳性率与S期比例随时间变化的趋势相似：两者均以7.5 h为界先升后降。

图 2(Figure 2)

图 2 H1299细胞热损伤（45 ℃×1 h）后加热组与对照组的EdU阳性率比较 Figure 2 Comparison of EdU positivity rate between heat exposure group(45 ℃ × 1 h) and control group. Data are presented as Mean±SD from 3 independent experiments (*P < 0.05, **P < 0.01).

本实验采用血清饥饿法同步周期，根据其结果可知H1299细胞经血清饥饿培养28 h再恢复全培18 h可有效使细胞同步至S期，其比例可达（69.27±0.81）%；而未经饥饿的细胞S期持续在（27.24±1.75）%。

图 3可看出S期H1299细胞热处理并恢复37 ℃培养0、2.5 h组细胞均未见明显的“彗星拖尾”现象，其OTM值与对照组亦无统计学差异（图 4）；正常培养5 h后开始出现明显的“慧尾”，OTM值与对照组有统计学差异（P < 0.05）。将OTM值与细胞周期变化比较可知OTM值变化趋势同S期比例变化（图 4）

图 3(Figure 3)

图 3 S期H1299细胞热损伤后的彗星图像 Figure 3 Comet images of S-phase synchronized H1299 cells at different time points after thermal exposure(Original magnification: × 20). A: 0 h; B: 2.5 h; C: 5 h; D: 7.5 h; E: 10 h; F: 12.5 h.

图 4(Figure 4)

图 4 S期H1299细胞热损伤（45 ℃×1 h）后尾力矩（OTM值）及细胞周期的变化趋势 Figure 4 Variation of Olive tail moment and cell cycle distribution in S-phase synchronized H1299 cells after heat exposure. Data are presented as Mean±SD from 3 independent experiments.

台盼蓝拒染实验结果（图 5）显示S期H1299细胞热损伤后恢复正常培养7.5 h前H1299细胞死亡率保持较低水平，7.5 h后死亡细胞迅速增多。

图 5(Figure 5)

图 5 台盼蓝拒染实验检测热处理（45 ℃×1 h）对S期H1299细胞死亡率的影响 Figure 5 Effect of heat exposure(45 ℃ × 1 h) on cell viability of S-phase synchronized H1299 cells measured by Trypan blue dye exclusion assay. Data are presented as Mean±SD from 3 independent experiments.

未加热细胞无ATM磷酸化，加热组细胞ATM磷酸化水平逐渐增高直至恢复正常培养5 h达最多，之后磷酸化水平下降至消失；加热后DNA结合的RAD18较对照组显著减少（图 6）。

图 6(Figure 6)

图 6 热损伤（45 ℃ × 1 h）后ATM磷酸化、DNA结合RAD18的变化 Figure 6 Changes of ATM phosphorylation and DNA binding RAD18 in cells after heat exposure (45 ℃×1 h).

热处理自用于肿瘤治疗以来常作为放、化疗的疗效“增敏剂”应用于临床^[7]，随着近几年磁流体热疗技术的发展，肿瘤热疗再次成为研究热点^[8]。目前研究者认为热疗增强放疗疗效的机制之一是放疗抵抗的S期细胞对热损伤敏感，两者存在互补杀伤作用^[9]，但S期细胞热损伤敏感的机制尚不清楚。有研究报道热处理可致细胞S期阻滞^[10]，我们的研究亦发现H1299热损伤后S期比例逐渐升高，且DNA复制活性迅速恢复（图 1、2）。Ghosal等^[11]认为当DNA损伤存在时细胞将启动S期阻滞以修复损伤，ATM的S1981位点磷酸化为周期阻滞调节通路的重要环节。故我们研究了热损伤后ATM磷酸化情况，其结果也支持上述发现（图 6），间接反应热损伤后细胞内形成了一定的碱基损伤，并进一步发生S期阻滞以利于损伤修复。

热疗增强放疗疗效的另一机制是热疗可抑制放疗形成的DSB损伤修复^[12]，但热疗本身可否形成DSB存在争议。Velichko报道热损伤后S期细胞仅产生DNA单链断裂（SSB），DSB主要来自非S期细胞^[2]。一般情况下，含SSB的细胞尚不足以导致细胞死亡，但细胞一旦存在一个DSB未修复即可引起细胞死亡；故上述报道与S期热损伤敏感相矛盾。本研究动态观察S期H1299细胞热损伤后“彗星拖尾”现象并分析其尾力矩值，结果显示S期细胞热损伤后延迟形成DSB，且DSB形成与细胞死亡密切相关（图 3、4、5），有文章报道热疗可促进细胞凋亡^[13]。我们分析Velichko未观察到S期细胞DSB形成可能是由于其观察时间较短（热后立马检测）所致。因PCR技术即使涉及95 ℃高温也未发生DNA链断裂，结合目前的研究结果可以看出S期阻滞细胞内的DSB为间接产生。有研究证实热处理可直接导致DNA碱基脱氨基及碱基位点缺失等损伤^[1]，并有研究发现氧化应激等导致的碱基损伤可在S期继续指导复制而形成DSB^[14]。综合分析前人关于细胞内DSB形成的观点及本研究的前述结果，我们推测S期细胞受热后DSB形成的机制为：DNA复制遭遇未及时修复的碱基损伤，复制叉无法继续前行而崩溃，进而形成DSB。故我们利用蛋白免疫印记实验对多个DNA损伤修复相关蛋白表达进行分析，研究结果首次证明热处理可抑制DNA跨损伤修复：热处理后跨损伤修复蛋白RAD18与DNA结合长时间受到抑制（图 6），而RAD18所主导的跨损伤修复通路对于修复复制叉所遭遇的DNA损伤极为重要^[15]。此结果支持我们关于DSB形成的猜想。

综上所述，本研究证实了S期细胞热损伤后可产生DSB，但具有延迟性特点；DSB形成的可能机制为：热损伤后DNA复制受影响较小或恢复迅速，而DNA跨损伤修复长时间受到抑制，导致复制叉遭遇不能及时修复的损伤而崩溃，然后间接形成DSB，最终导致细胞死亡。本研究丰富了肿瘤热疗可能作用机制的理论基础，使热疗有望单独应用于临床，但其详细机制有待进一步研究。