人淋巴瘤细胞株Ramos、Raji、U937、SNK-6、HUT-78、Daudi购自美国ATCC，α-MEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco，Lipofectamine^TM LTX and Plus Reagent转染试剂盒购自美国Invitrogen，G418购自北京索莱宝科技有限公司，TRIzol试剂、PrimeScript^TM RT reagentKit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR^® Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，兔抗人AXIN 、β-catenin 、MMP7、MMP9和α微管蛋白（α-Tubulin）多克隆抗体购自美国Proteintech，山羊抗兔IgG（二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，化学发光检测试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ，T₄DNA连接酶，pyrobest DNA聚合酶，DpnⅠ酶，质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，一步法RT反转录试剂盒及大肠杆菌DH5α感受态细胞购自大连宝生物公司（TaKaRa）；设计的AXIN、β-catenin等序列及相关引物由上海生工公司合成；pCMV5-HA、pcDNA5-His质粒购自promega；AXIN-shRNA、β-catenin-shRNA购自上海吉玛制药技术有限公司

置于37 ℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中培养，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液换液传代培养。选取AXIN低表达的Raji细胞后，，按新型脂质体Lipofectamine^TM LTX and Plus Reagent转染试剂说明用不含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行转染，分别转染pCMV5-HA-Axin和pcDNA5-His-β-catenin及共转，设置空白对照组，于转染4~6 h后更换含有10%胎牛血清的α-MEM培养液中继续培养，48 h后质粒高表达期提取细胞RNA和总蛋白。在稳定高表达AXIN的Raji细胞中，采用相同方法及分组转染干扰质质粒。

根据Genbank的基因序列设计引物，具体见表 1。提取人淋巴瘤细胞Raji和Daudi中的总RNA，以总RNA为模板反转录为cDNA。进行PCR扩增反应，利用T4 DNA连接酶连接β-catenin全长片段与pcDNA5-His空载体，连接Axin全长片段与pCMV5-HA载体，然后将连接产物转化到DH5α感受态大肠杆菌，扩增后抽提质粒DNA，酶切及测序验证。

表 1(Table 1)

表 1 PCR引物序列、产物大小及复性温度 Table 1 PCR primers, product length and anealing temperatures Gene Primer sequence Product length(bp) Anealing Temperature AXIN Sence:5'-CTGGTGTCCTTGCTGATAC-3' 184 55.4 Antisence:5'-TGTCTTGGTCGTTGTCTTC-3' β-catenin Sence:5'-ACCTGAGACTGGATGTAGAA-3' 158 53.2 Antisence:5'-GCTGGAATGACAACTGGAT-3' MMP7 Sence:5'-AGGCTCAGGACTATCTCAA-3' 276 276 Antisence:5'-CCACTGTAATATGCGGTAAG-3' MMP9 Sence:5'-GGAAGATGCTGCTGTTCA-3' 210 57.8 Antisence:5'-CCACCTGGTTCAACTCAC-3' GAPDH Sence:5'-CATCACCATCTTCCAGGAG-3' 213 56.1 Antisence:5'-AGGCTGTTGTCATACTTCTC-3'

表 1 PCR引物序列、产物大小及复性温度 Table 1 PCR primers, product length and anealing temperatures

取对数生长期的人淋巴瘤细胞Raji细胞接种于6孔板中（2×10⁵细胞/孔），待细胞融合度为70%~80%时，按Lipofectamine^TM LTX and Plus Reagent转染试剂盒说明书提供的方法分别将重组载体pCMV5-HA-Axin质粒和阴性对照载体转染至Raji细胞。转染48 h后，加入1000 μg/mL的G418进行筛选，有阳性克隆长出时，在荧光显微镜下标记后挑取单克隆细胞进行培养，在96孔板中以有限稀释法筛选和纯化稳定转染的单克隆细胞并扩大培养，培养过程中应用500 μg/mL G418维持培养。荧光显微镜下观察筛选后各组细胞绿色荧光蛋白的表达情况。成功转染重组载体质粒后的细胞称pCMV5-HA-Axin-Raji。

收集未经处理的多种淋巴瘤细胞株细胞以及过表达AXIN或β-catenin的Raji细胞、干扰AXIN或β-catenin的稳定高表达细胞，应用TRIzol试剂和PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）分别提取各组细胞的总RNA，并将其反转录成cDNA反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s），随后以此cDNA为模板应用SYBR^® Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseHPlus）进行PCR扩增。PCR反应条件： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。以2^-ΔΔCt值表示各基因mRNA的相对表达水平。

收集未经处理的多种淋巴瘤细胞株细胞以及过表达AXIN或β-catenin的Raji细胞、干扰AXIN或β-catenin的稳定高表达细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。取20 μg/孔蛋白质进行10% SDSPAGE，将电泳分离后的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液于室温下封闭1 h；加入1:1000稀释的抗AXIN和α-Tubulin（内参照）抗体，4 ℃反应过夜；TBST

漂洗3次，加入1:10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG（二抗），室温反应l h；TBST漂洗3次，加入化学发光试剂显影成像，应用Image Lab软件进行蛋白条带灰度值的分析。以目的蛋白条带的灰度值与内参照α-Tubulin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

使用Transwell检测空白处理对照组、稳定高表达AXIN组、干扰AXIN的稳定高表达AXIN组细胞的侵袭能力变化。取对数期生长的Raji细胞，经过胰酶消化下来，低速离心后，大约按2×10⁵细胞数加入到每个小室，用不含血清的培养液进行培养，放置在含有10%的血清培养液的24孔板上，放置在5% CO₂、37 ℃封闭环境内孵育24 h，甲醛固定20 min，用0.1%结晶紫染色20 min，用PBS洗3遍。显微镜（×200）下计数迁移至滤膜外表面的细胞数，取平均值，实验重复3次。

采用SPSS19.0统计软件，数据以均数±标准差表示，两组间数据的比较采用t检验，多组间数据的比较采用方差分析，组间两两比较采用Tukey法或Dunnett's T₃法进行分析，P < 0.05为差异有统计学意义。本研究中的所有实验均重复3次。

用RT-PCR和Western blotting法观察多株淋巴瘤细胞株里AXIN、β-catenin、MMP7、MMP9的mRNA及蛋白表达情况。结果发现：观察蛋白水平，Raji细胞中AXIN相对低表达；当AXIN升高时，β-catenin、MMP7、MMP9降低，当AXIN降低时，β-catenin、MMP7、MMP9呈升高趋势（图 1）。推测AXIN与β-catenin、MMP7、MMP9呈负相关。

图 1(Figure 1)

图 1 在多株淋巴瘤细胞株里AXIN、β-catenin、MMP7、MMP9的表达情况 Figure 1 Expression of Axin, β-catenin, MMP7 and MMP9 at the protein (A, Western blotting) and mRNA (B, qRTPCR) in different lymphoma cell lines.

对于Raji细胞组分空白对照组、pCMV5-HA-Axin、pcDNA5-His-β-catenin、pcDNA5-His-β-catenin+ pCMV5-HA-Axin这4组，HUT-78细胞组分空白对照组、AXIN-shRNA、β-catenin-shRNA和AXIN-shRNA+ β-cateni-shRNA这4组。采用RT-PCR和Western blot法检测各个基因的蛋白及mRNA水平。图 2A结果显示：过表达Axin的细胞中，β-catenin、MMP7、MMP9蛋白水平较空白对照组明显下降，MMP7、MMP9 、β-catenin mRNA未变化；过表达β-catenin的细胞中，MMP7、MMP9蛋白及mRNA水平较空白对照组明显升高，而Axin未见明显变化；过表达Axin和过表达β-catenin的细胞中，β-catenin、MMP7、MMP9表达较过表达β-catenin组明显下降。图 2B HUT-78细胞株的结果与Raji细胞株的蛋白水平结果相反，mRNA水平结果同样说明Axin不影响β-catenin、MMP7、MMP9的mRNA。说明蛋白水平，升高Axin可以下调β-catenin、MMP7、MMP9的表达水平，而且Axin可以恢复过表达β-catenin产生的影响。

图 2(Figure 2)

图 2 在Raji 和HUT-78细胞中过表达和干扰AXIN或β-catenin中MMP7、MMP9的表达情况 Figure 2 Expression of MMP7 and MMP9 in Raji and HUT-78 cells after overexpressing and interfering AXIN or β-catenin. A: Protein expressions in Raji cells; B: mRNA levels in Raji cells; C: Protein expressions in HUT-78 cells; D: mRNA levels in HUT-78 cells. *P<0.05. NS: No significance.

在稳定高表达Axin的Raji细胞中，分四组分别转染空白干扰片段、AXIN-shRNA、β-catenin-shRNA、AXIN-shRNA + β-catenin-shRNA。用RT-PCR和Wes-tern blot技术分别检测各个基因表达情况。结果显示：构建稳定高表达Axin的Raji细胞株成功；干扰Axin的pCMV5-HA-Axin-Raji后，β-catenin、MMP7、MMP9蛋白水平较空白干扰组明显升高，MMP7、MMP9、β-catenin mRNA未变化；干扰β-catenin的pCMV5-HA-Axin-Raji后，MMP7、MMP9表达较空白干扰组明显下降，而Axin未见明显变化；干扰Axin和β-catenin的细胞后，β-catenin、MMP7、MMP9表达较干扰β-catenin组明显升高（图 3）。说明降低Axin可以上调β-catenin、MMP7、MMP9的表达水平，而且Axin可以恢复干扰β-catenin产生的影响。

图 3(Figure 3)

图 3 在 稳 定 高 表 达 AXIN 细 胞 中 干 扰AXIN或β-catenin中MMP7、MMP9的表达情况 Figure 3 Expression of MMP7 and MMP9 proteins (A) and mRNA (B) in cells overexpressing Axin after AXIN or β-catenin knockdown. *P<0.05. NS: No significance.

Transwell侵袭实验结果显示：稳定高表达Axin组Raji细胞穿膜细胞数48±2.74明显低于空白处理对照组90±6.63及干扰AXIN的稳定高表达AXIN组76±4.69（P=0.024，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 AXIN调节MMP7、MMP9对淋巴瘤细胞侵袭能力的影响 Figure 4 Effect of Axin-mediated regulation of MMP7 and MMP9 on invasion ability of lymphoma cells.

在全球范围内，恶性淋巴瘤的发病率近30年来已高达20/10万。在我国恶性淋巴瘤也已是常见肿瘤第8位，发病率高达6/10万~7/10万^[11]。而且淋巴细胞分布全身各部，一旦恶变，手术切除效果有限，临床治疗需结合放化疗^[12]。生物治疗已成为恶性淋巴瘤的第四治疗方式。无论何种治疗方式，淋巴瘤的浸润和转移是造成预后不良患者死亡的主要原因。本文从转移相关基因MMP7、MMP9开始研究，进一步研究了AXIN-β-catenin-MMP7/MMP9转移机制轴。为了研究AXIN在淋巴瘤细胞的侵袭和转移的内在机制，我们进一步实验发现改变Axin后，发现β-catenin的蛋白含量明显发生变化，而β-catenin mRNA水平无明显变化，证实AXIN虽然不影响β-catenin的转录，但通过诱导其降解可以显著下调β-catenin在细胞内的含量，这与其他实验室的研究结果一致。

先前研究报道过，肿瘤细胞发生侵袭时，肿瘤细胞通过扩散并逐渐侵入细胞外基质（ECM），肿瘤细胞和基质细胞通过分泌蛋白酶导致ECM的降解，从而使基底膜缺损，肿瘤细胞可以由这种方式进入血管，向远处进行转移^[13-14]，肿瘤细胞或肿瘤间质组织产生降解ECM的主要是蛋白水解酶，目前认为最为重要的是基质金属蛋白酶系列（MMPs）^[15]。MMP7、MMP9属于MMPs家族中的一员，而且MMP7、MMP9是MMPs家族最重要的蛋白酶之一^[16]。AXIN与肿瘤的转移研究并非我们首次报道，AXIN是1997年从一种称为Fused的小鼠突变株中克隆到的基因^[17]。AXIN以构架蛋白的形式在Wnt信号转导途经中起负调节作用^[18]。Xu等^[19]研究认为AXIN的表达减少与肿瘤的TNM分期和淋巴结转移相关，并是食管鳞癌进展的重要原因之一，这与我们在淋巴瘤里研究一致。非小细胞肺癌中研究存在着AXIN的表达减少时，出现β-catenin的核蓄积和肺癌的低分化^[20]，我们在淋巴瘤中研究也发现AXIN与β-catenin呈负相关。大量研究证实AXIN能与Wnt信号途径中的许多成员相互结合从而影响wnt/β-catenin信号通路影响细胞的功能。β-catenin是经典的cadherin-catenin复合体和Wnt通路的重要成员，其异常蓄积对肿瘤的恶性增殖和侵袭转移有重要作用^[21-22]。AXIN作为调控β-catenin蛋白降解的关键分子，对保持Wnt通路的低活性状态，调节细胞的增殖和凋亡具有重要作用^[23]。这与我们研究结果相一致，说明AXIN在诱导β-catenin降解和分布，抑制肿瘤发生、发展和侵袭方面发挥重要作用。AXIN与MMP7、MMP9的关系并没有学者研究过，我们首次在实验中发现AXIN相对低表达的Raji细胞中转染过表达AXIN质粒后，与侵袭相关的靶基因MMP-7、MMP9表达减少，进而导致淋巴瘤细胞的侵袭转移能力减弱，而共转染β-catenin质粒会使淋巴瘤细胞的侵袭转移能力恢复；在稳定高表达AXIN的Raji细胞中转染Axin-shRNA，MMP7、MMP9表达上升，进而导致淋巴瘤细胞的侵袭转移能力增强，当共转染β-catenin-shRNA会使淋巴瘤细胞的侵袭转移能力下降。证明β-catenin在AXIN和MMP7、MMP9之间起着桥梁作用。

综上所述，肿瘤细胞浸润转移过程中最为重要的过程无疑是ECM的降解导致的，研究已证实MMPs是降解ECM的重要蛋白水解酶家族，能降解ECM和BM所有成分从而导致肿瘤细胞的侵袭和转移^[24-26]。而且我们首次证实AXIN通过β-catenin调控侵袭相关的靶基因MMP-7、MMP9的表达，进而影响淋巴瘤细胞侵袭转移能力。本研究阐述了AXIN抑制淋巴瘤细胞的侵袭转移能力的机制，为淋巴瘤靶向治疗提供了新的理论依据和实验基础。