近年来活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）对皮肤的损伤作用受到人们的广泛重视^[1-2]。ROS是正常氧代谢的副产物，在细胞信号传导，维持机体稳态中发挥重要作用^[3]。然而在病理条件或外界环境影响下（例如暴露于紫外线或热源等），ROS急剧增多^[3-4]，对细胞产生损伤称为氧化应激（oxidative stress, OS），目前OS被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。研究显示NADPH氧化酶(NADPH oxidase, Nox)家族是ROS的主要来源，在氧化应激中具有关键作用，而其在皮肤OS中研究较少。H₂O₂作为ROS的主要成员之一，可直接或间接损伤细胞，诱导细胞凋亡和坏死^[5]，被广泛应用于体外氧化应激模型的诱导^[6-7]。本文拟以H₂O₂建立人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HFbs）氧化应激损伤模型，以此为基础探讨NADPH氧化酶在H₂O₂诱导的HFbs氧化损伤中的作用。

胎牛血清（BI），Ⅰ型胶酶、DispaseⅡ、MTT以及二苯基氯化碘盐（Diphenyleneiodonium chloride, DPI）（Sigma），DCFH-DA荧光探针（南京建成生物工程研究所），小鼠抗波形蛋白单克隆抗体（Vimentin）和FITC标记山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥），兔抗人gp91phox多克隆抗体（abcam），鼠抗人Gapdh多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔IgG二抗和HRP标记山羊抗鼠IgG二抗（Bioword），H₂O₂（国产分析纯）。

包皮组织由南方医科大学南方医院泌

尿外科提供，源于4位健康行包皮环切术者，年龄分别是18、18 、20和25岁，并经患者本人同意。

包皮组织于超净台内用含青霉素和链霉素PBS洗3次，剪去皮下结缔组织和脂肪，0.1% Dispase Ⅱ 4 ℃过夜，分离表皮和真皮，将真皮剪碎至1 mm³，加入5倍体积0.1% Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化0.5~1 h后加入等体积全培终止消化，200钼钢网滤过，1500 r/min，离心10 min，弃上清PBS洗2次。最后加入含10% FBS的DMEM培养基，37 ℃、5% CO₂孵箱培养。待细胞70~80%融合，常规胰酶消化传代。第3~6代细胞用于正式实验。

免疫荧光法鉴定：取第3代HFbs，按1×10⁵接种于覆有盖玻片的6孔板中，待细胞生长成单层，取出细胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100透化2~5 min，5%BSA室温封闭30 min，孵育小鼠抗波形蛋白单克隆一抗1:100 4 ℃过夜，避光孵育荧光二抗1:200 2 h，DAPI染核，甘油封片，荧光显微镜下观察。PBS代替一抗作阴性对照。

取对数生长期细胞按5×10³个细胞接种于96孔板，24 h后换用1%全培使细胞同步化24 h后分别加入200、400、600、700以及800 μmol/L H₂O₂，另设正常对照组和空白对照组，每组6个复孔，作用2、4、8、12以及24 h后，每孔加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），37 ℃孵育4 ｈ；弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min。酶标仪于波长490 nm测各孔吸光度（A）值，计算细胞活力，选择处理24 h细胞活力下降30%~40%的H₂O₂浓度用于构建HFbs氧化应激损伤模型。确定H₂O₂处理条件后，将实验分为正常组、氧化损伤组（H₂O₂处理）、抑制剂组（先予以Nox抑制剂DPI预处理2 h后再加H₂O₂处理，DPI浓度参考Liu等^[8]研究），观察各组细胞形态变化及MTT法测定细胞活力。

取对数生长期细胞，按以上处理后收集细胞计数调整各组细胞数一致，37 ℃孵育DCFH-DA荧光探30 min，PBS洗去多余探针，多功能酶标仪测定各组在激发波长488 nm，发射波长525 nm处荧光值。

用蛋白质印记法检测各组细胞gp91phox表达。收集各组细胞，PBS洗2次，RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，行聚丙酰胺凝胶电泳（蛋白上样量为40 μg/泳道），PVDF膜湿转，5%脱脂奶粉封闭1~2 h，4 ℃孵育一抗过夜，稀释浓度为1:500，室温孵育二抗1~2 h，稀释浓度为1:5000。ECL化学发光试剂盒发光、显影。

SPSS 19.0进行统计分析。所有数据均采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，如方差齐性，采用LSD-t法进行两两比较；如方差不齐，采用Dunnett's T₃法进行两两比较。P < 0.05认为差异有统计学意义。

倒置显微镜下观察细胞体积较大，呈长梭形（图 1A）。免疫荧光结果显示：细胞核呈蓝色，卵圆形，Vimentin定位在胞质，呈绿色荧光，高表达相对特异的标记物Vimentin（图 1B），再根据其组织来源证实为HFbs，阴性对照组无阳性荧光表达（图 1C）。

图 1(Figure 1)

图 1 人真皮成纤维形态学观察及鉴定 Figure 1 Morphological observation and identification of cultured human dermal fibroblasts (HFbs). A: Dermal fibroblasts (Original magnification: ×100); B: Vimentin(+)(×400); C: Negative control(×400).

不同浓度H₂O₂使HFbs细胞活力下降，并呈浓度（图 2A）和时间依赖（图 2B）。H₂O₂ 700 μmol/L处理24 h后，细胞活力较正常组下降40%（P < 0.05），差异有统计学意义。

图 2(Figure 2)

图 2 H2O2对Hfbs细胞活力的影响 Figure 2 Effect of H2O2 on the viability of cultured HFbs. A: H2O2 exposure for 24 h concentration-dependently reduces the cell vitality (*P < 0.05 vs normal cells); B: At the concentration of 700 μmol/L, H2O2 time-dependently reduces the cell vitality (*P < 0.05 vs normal cells).

光镜下示100 μmol/L H₂O₂处理24 h后对细胞形态无明显影响（图 3B），随着浓度增加至700 μmol/L，H₂O₂可使HFbs形态发生明显改变，细胞皱缩，体积变小、细胞间隙增大（图 3C）；而抑制剂组在加入DPI后与氧化损伤组相比体积增大，细胞数目增加（图 3D），同时MTT结果显示抑制剂组细胞活力较氧化损伤组明显升高（P < 0.05）差异有统计学意义（图 4），然而不同浓度DPI处理后各组差异并无统计学意义。

图 3(Figure 3)

图 3 DPI对HFbs细胞形态影响 Figure 3 Effect of NADPH oxidase inhibitor on the morphology of HFbs (Original magnification: ×100). A: Normal control group; B: Cells treated with 100 μmol/L H2O2 for 24 h; C: Cells treated with 700 μmol/L H2O2 for 24 h; D: Cells pretreated 1 μmol/L of NADPH oxidase inhibitor for 2 h before exposure to 700 μmol/L H2O2 for 24 h.

图 4(Figure 4)

图 4 DPI对HFbs增值的影响 Figure 4 Effect of NADPH oxidase inhibitor on proliferation of HFbs. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs oxidative stress injury group.

H2O2处理2 h后HFbs细胞内ROS明显升高，并呈浓度依赖（图 5A），而经DPI预处理后抑制剂组与氧化损伤组相比细胞内ROS水平明显下降（P < 0.05），差异有统计学意义；而与正常组相比细胞内ROS未见明显升高（P>0.05），如图 5B所示。

图 5(Figure 5)

图 5 细胞内ROS变化 Figure 5 Changes of intracellular ROS in the cells. *P < 0.05 vs normal group; #P < 0.05 vs oxidative stress injury group.

Western blotting显示正常HFbs gp91phox表达较低，而在不同浓度H₂O₂处理24 h后其表达较正常组升高并呈浓度依赖（图 6）。而如图 7所示抑制剂组加入DPI处理后与氧化损伤组比较可明显降低gp91phox的表达。

图 6(Figure 6)

图 6 H2O2以浓度依赖的方式增加gp91phox表达 Figure 6 H2O2 increased the expression of gp91phox in HFbs in a concentration-dependent manner.

图 7(Figure 7)

图 7 DPI降低H2O2诱导的gp91phox表达 Figure 7 NADPH oxidase inhibitor decreased H2O2-induced expression of gp91phox in HFbs.

正常情况下，HFbs内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，一旦平衡被打破，ROS过度积累，就会引发氧化链式反应和脂质过氧化反应从而引发皮肤疾病和衰老^[9-11]。H₂O₂是主要的活性氧之一，作为膜易透性氧化剂，可在多种细胞培养模型中引起细胞损伤^[12-15]。本实验中加入外源性H₂O₂诱导HFbs氧化应激损伤，结果显示随着H₂O₂浓度和作用时间增加氧化损伤组细胞活力逐渐下降，H₂O₂ 700 μmol/L处理24 h后，细胞活力下降40%。实验发现H₂O₂ 100 μmol/L时细胞活力较正常组已有下降，但光镜下细胞形态未见明显改变，然而随着H₂O₂浓度增加，光镜示细胞数量减少、皱缩，失去原有形态且培养基细胞碎片增多。研究表明ROS水平直接反映了细胞内氧化应激的程度^[16]，本实验检测细胞内ROS水平亦与细胞损伤相一致，随着细胞活力下降ROS升高也越来越明显，在H₂O₂ 700 μmol/L处理2 h后ROS较正常组升高2倍。以上结果说明随着H₂O₂浓度的增加表现出明显的损伤效应，先是细胞功能的改变（ROS升高），损伤积累到一定程度就触发了细胞不可逆的损伤（细胞活力下降）。

研究显示NADPH氧化酶是体内催化生成ROS的主要酶体^[17-18]，由胞膜gp91phox、p22phox亚单位和胞质p47phox、p67phox、p40phox、小GTP酶和Rac亚单位组成，gp91phox是其主要的功能亚单位。在不同细胞中发现一系列gp91phox的同源物，统称为Nox蛋白家族。人类Nox基因组包括7个成员，即Nox1~5、Duox1和Duox2，gp91phox亦称为Nox2。Nox通过配体诱导方式感受胞外信息，外来信号刺激使其激活或失活，从而迅速升高或降低细胞内的ROS水平^[19]。Spadoni等^[20]发现在系统性硬化病成纤维细胞中Nox2和Nox4表达增加诱导ROS过度产生，并在细胞异常活化和DNA损伤起着至关重要的作用。Zhang等^[21]证实TGF-ß1活化Nox，可诱导Nox2表达升高促使ROS积聚加速皮肤纤维化进程，并且这一作用可被DPI和Nox2siRNA减弱。研究发现，心肌缺血再灌注时，Nox2基因表达显著上调，伴随活性氧水平升高，提示Nox2在介导心肌缺血再灌注氧化损伤中起主要作用^[22]。宋晖等^[23]认为热损伤可激活人皮肤成纤维细胞Nox并促进其蛋白表达，增加ROS产生，细胞内升高的ROS可进一步促进PGE2的释放，从而促进参与创伤修复早期阶段的炎症反应。这些研究表明Nox，特别是Nox2与多种疾病的发生发展都有着密切的联系。本实验结果示正常HFbs中gp91phox表达较低，而在H₂O₂刺激后明显上调，并与细胞内ROS水平和细胞损伤程度相一致。这些研究都提示H₂O₂可能是通过诱导Nox活化，进一步导致ROS累积并加重氧化应激反应。

为探讨NADPH氧化酶在氧化应激损伤中的作用，我们在抑制剂组加入DPI预处理2 h后再加入H₂O₂，结果显示DPI抑制了gp91phox的表达，细胞活力较氧化损伤组明显升高，细胞内ROS水平几乎恢复至正常水平，有效保护了H₂O₂对HFbs的氧化损伤。由此推测DPI可抑制Nox重要功能亚基gp91phox的表达，减少H₂O₂诱导的ROS积聚，从而实现对细胞的保护作用，而MTT结果显示抑制剂组细胞活力仍低于正常组，考虑H₂O₂本身为较强的活性氧物质，可直接损伤细胞，DPI可能仅抑制H₂O₂对Nox的活化，从而减轻H₂O₂引发的氧化链式反应和脂质过氧化反应以此保护细胞。

综上所述，Nox在H₂O₂导致的氧化应激损伤中具有重要作用，DPI有效保护H₂O₂对HFbs的氧化损伤，且这一保护效应可能是通过抑制gp91phox的表达起作用，结合以往研究：NADPH氧化酶在皮肤纤维化和创伤修复的炎症反应阶段都具有重要作用，皮肤的氧化损伤、纤维化和炎症反应都是引发皮肤衰老的主要原因^[24]，本研究表明通过抑制Nox能够防止皮肤HFbs氧化损伤，因此对于保护皮肤组织正常结构、功能和延缓皮肤衰老具有重要意义，同时也为改善皮肤衰老提供了一条新的防治思路。除gp91phox在H₂O₂诱导的HFbs氧化损伤中的变化外，其他Nox亚型及其在皮肤光老化中的作用也应进一步研究。