口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其中舌癌又是最常见的口腔癌，多数为鳞癌。近年来舌癌的发病率有增高趋势，但患者的生存率却无明显改善。大部分患者确诊时已经是晚期，处于第Ⅲ期或第Ⅳ期，这是降低患者生存率的一个重要因素^[1-2]。因此，预防舌癌的发生，探索其发病机制，发现新的早期诊断标志物成为目前研究的重点。Ki-67、p53、HOX基因和Ⅳ型胶原酶等是近年来发现的较新的口腔鳞癌的生物学标志物，对诊断和治疗口腔鳞癌意义重大^[3]。有研究表明富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG-1）在肝癌^[4]、胰腺癌^[5]、卵巢癌^[6]、肺癌^[7]和结直肠癌^[8]等多种肿瘤中的表达较正常人高。又有研究发现LRG-1表达升高与血管生成有密切关系^[9]。血管生成是指在原有的毛细血管和（或）微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖，从已存在的血管处以芽生或非芽生形式形成新的、以毛细血管为主的血管系统过程。内皮细胞活化增殖是血管生成的起始阶段^[10]。故研究血管内皮细胞的增值情况即可大致反应血管生成的情况。但LRG-1在舌癌中的表达情况及其参与舌癌发生、发展的相关机制尚不清楚。本实验旨在体外检测LRG-1在舌癌组织及细胞系的表达，以及LRG-1对人血管内皮细胞增殖及小管形成的影响，初步探讨其在舌癌组织中的表达变化及其对肿瘤血管生成的影响，为进一步研究其生物学作用及可能存在的致病机制提供实验依据。

RPMI 1640培养基：美国Corning。胎牛血清：美国Gibco。兔抗人LRG-1单抗、HRP标记的驴抗兔IgG、PE标记的鼠抗兔IgG：美国LifeSpan BioSciences。重组人LRG-1：上海江莱生物科技有限公司。噻唑蓝（MTT）：美国Sigma进口分装。Matrigel：美国BD。

人舌癌细胞株Tca8113细胞由上海拜力生物公司购得；人脐静脉内皮细胞HUVEC由ATCC细胞库购得。

2005~2015年辽宁医学院附属第一医院病理科保存的浸润性舌癌标本40例，舌部不典型性增生组织20例、舌原位癌组织20例，患者术前均未接受化疗及放疗。其中浸润性舌癌中男性28例，女性12例，年龄40~75岁，平均52岁。组织学分类：高分化15例，中低分化25例。有淋巴结转移22例，无淋巴结转移18例。根据国际抗癌联合会（UICC）分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期12例，Ⅲ期6例，Ⅳ期5例。所有标本均经镜下病理检查证实。40例癌旁正常组织均采用距离肿瘤至少2 cm且术中病理证实切缘为阴性的舌体组织。临床病理资料包括性别、年龄、分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期。

选取与HE染色一致的典型蜡块做4 μm厚连续切片。切片脱蜡至水，3% H₂O₂消除内源性过氧化物酶，组织抗原微波加热修复，5% BSA封闭非特异性抗原，加入兔抗人LRG-1单抗，4 ℃过夜，滴加HRP标记的驴抗兔IgG工作液，37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次，5 min/次；DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。染色结果判读：镜下观察以肿瘤细胞中出现清晰棕黄色颗粒判定为阳性细胞。根据反应强度和范围分为：阴性（-）：未见阳性细胞；阳性（+）：阳性细胞未超过半数且染色较浅；强阳性（++）：阳性细胞超过半数且染色较深。

舌癌细胞株Tca8113、人脐静脉内皮细胞HUVEC均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（内含青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L）培养，置于含5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中。每1~2 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

取对数生长期细胞，常规胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心弃上清，再经PBS缓冲液洗涤两次。BD破膜试剂盒进行破膜，重悬细胞，在实验组细胞悬浮液中加入5 μL兔抗人LRG-1单抗，同型组加入同型一抗，轻轻混匀后于2~8 ℃避光条件下孵育30 min，洗涤，再加入5 μL PE标记的鼠抗兔IgG后轻轻混匀于2~8 ℃避光条件下孵育30 min，洗涤，200 μL PBS重悬，上机行流式细胞仪检测。实验重复3次。

临床上所取新鲜舌癌组织及癌旁组织冲洗后剪碎，匀浆，裂解后抽提蛋白并定量；Tca8113细胞预冷PBS冲洗，裂解后抽提蛋白并定量。取50 μg总蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加兔抗人LRG-1单抗及β-actin单抗4 ℃孵育过夜、洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜，ECL法显色后GIS凝胶图像分析系统拍照并分析处理。以上实验重复3次。1.4.5 MTT法检测内皮细胞增殖情况将处于生长对数期的HUVEC细胞经胰酶消化、重悬、按每孔100 μL种于96孔板，每孔含1000个细胞，设4个复孔，5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养24 h，弃去培养液。加入LRG-1浓度为5、10、20、40、50 μg/mL的培养液，另设置不加LRG-1的阴性对照组和阳性对照组血管内皮生长因子-VEGF（10 ng/mL）。继续培养6 h后，每孔加入15 μL MTT，4 h后吸弃孔中液体，每孔加入100 μL DMSO，摇床震荡10 min，使结晶物溶解。酶标仪在570 nm波长下检测每孔的吸光度（A）值，以上实验重复3次。

Matrigel基质胶4 ℃过夜冻融，次日，在预冷的96孔板中加入50 μL融化的Matrigel基质胶溶液，在37 ℃放置30 min成胶。按细胞悬液2×10⁴/孔加入板中，放入CO₂培养箱培养24 h。分为阴性对照组和实验组，实验组分别是LRG-1浓度为5、10、20、40、50 μg/mL，每组设置5个复孔。CO₂培养箱培养6 h。光学显微镜下观察内皮细胞小管的形成情况，每孔随机取5个视野，数码相机拍照，计数形成的小管的个数。

采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计数资料组间比较采用χ²检验；计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料与计量资料的统计分析均以P < 0.05为有统计学意义。

结果显示，LRG-1在舌癌组织中呈不同程度的表达（图 1）。LRG-1的表达主要定位于胞浆中，细胞核亦可见染色，各标本LRG-1着色深浅不一。癌旁组织不表达LRG-1或仅在上皮基底细胞层显弱阳性着色。40例浸润性舌癌组织中，34例LRG-1呈阳性表达，阳性表达率为85%；癌旁正常组织中，4例LRG-1阳性表达，阳性表达率为10%；χ²=45.113，P < 0.05，差异有统计学意义。因此得出：舌癌组LRG-1阳性率高于癌旁组。20例舌部不典型性增生组织中LRG-1的阳性表达率为30%；20例舌原位癌组织中LRG-1的阳性表达率为50%；二者与浸润性舌癌组织比较，差异均有统计学意义（P < 0.05，表 1）。另外，LRG-1在浸润性舌癌组织中的表达与患者年龄、性别等不相关，而与组织分化程度、临床分期及淋巴结转移有相关性（P < 0.05），组织分化程度越低和临床分期越高的舌癌组织中LRG-1的表达越高。发生淋巴结转移的舌癌组织中LRG-1的表达较未转移者高（表 2）。

图 1(Figure 1)

图 1 LRG-1在舌癌组织中呈不同程度的表达 Figure 1 Expression of LRG-1 in human TSCC tissue (Original magnification: × 400). A: Strong positive expression (++); B: Weak positive expression (+); C: Negative expression (-).

表 1(Table 1)

表 1 LRG-1在不同类型舌组织中的表达 Table 1 Expression of LRG-1 in different tongue tissues Tissue Total number Number of LRG-1 (+ and ++) Positive rate of LRG-1 (%) Invasive tongue cancer 40 34 0.85% Normal tissue beside tongue cancer 40 4 10%* Tongue atypical hyperplasia 20 6 30%* Tongue cancer in situ 20 10 50%* *P < 0.05 vs invasive tongue cancer.

表 1 LRG-1在不同类型舌组织中的表达 Table 1 Expression of LRG-1 in different tongue tissues

表 2(Table 2)

表 2 LRG-1表达的强弱与舌癌临床病理参数的关系 Table 2 Relationship between LRG-1 expression and clinicopathological parameters of tongue cancer Clinical characteristics Number of LRG-1 (+ and ++) LRG-1 （++） LRG-1 （+） P Clinical stage   Ⅰ-Ⅱ 23 12 11 0.027   Ⅲ-Ⅳ 11 10 1 Differentiation   Well 10 3 7 0.006   Moderately   and Poorly 24 19 5 LN metastasis   Yes 22 18 4 0.005   No 12 4 8 Gender   Male 23 17 6 0.104   Female 11 5 6 Age（year）   ≥52 21 16 5 0.075    < 52 13 6 7

表 2 LRG-1表达的强弱与舌癌临床病理参数的关系 Table 2 Relationship between LRG-1 expression and clinicopathological parameters of tongue cancer

用流式分析软件分析得出，实验组LRG-1呈阳性表达（图 2）。Tca8113细胞中LRG-1阳性细胞的百分数：同型对照组为0.15±0.04，实验组为89.37±7.00，实验组与同型对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；Tca8113细胞中LRG-1阳性细胞的平均荧光强度：同型对照组为587±171.67；实验组为2708±184.19，实验组与同型对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。

图 2(Figure 2)

图 2 Tca8113细胞中LRG-1的表达情况 Figure 2 Expression of LRG-1 in Tca8113 cells. A: Flow cytometric analysis of the percentage of LRG-1+ cells in Tca8113 cells; B: Comparison of the percentage of LRG-1+ cells (*P < 0.05); C: Analysis of the mean fluorescence intensity of LRG-1+ cells by flow cytometry; D: Comparison of the MFI of LRG-1+ cells (*P < 0.05).

结果显示在舌癌组织及舌癌细胞Tca8113中可以看到明显条带，而在癌旁正常组织中条带较浅，说明舌癌组织及舌癌细胞Tca8113中LRG-1表达水平高于癌旁正常组织（图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blotting检测舌癌组织及Tca8113中LRG-1的表达 Figure 3 Western blotting for detecting the expression of LRG-1 in the human TSCC tissue and Tca8113 cells. A: Tca8113 cells; B: Tongue squamous cell carcinoma (TSCC) tissue; C: Adjacent tissues of TSCC.

实验中使用不同浓度的LRG-1（0、5、10、20、40、50 μg/mL）及VEGF（10 ng/mL）处理HUVEC细胞6 h后，MTT法检测LRG-1对HUVEC细胞活力的影响。结果表明，随着LRG-1浓度的升高，内皮细胞的活性及数量不断增高（表 3）。不同浓度的LRG-1组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；不同浓度的LRG-1组间比较差异也有统计学意义（P < 0.05）。且LRG-1浓度为50 μg/mL时，血管内皮细胞的活性高于阳性对照组-VEGF（10 ng/mL）处理组（P < 0.05）。结果表明LRG-1能明显促进HUVEC细胞生长。

体外小管形成实验结果表明LRG-1能够促进HUVEC的体外小管形成。且随着LRG-1浓度的升高，小管数目逐渐增多，且结构也变得紧密完整（图 4）。

表 3(Table 3)

表 3 LRG-1对HUVEC细胞增殖的影响 Table 3 Effect of LRG-1 on proliferation of HUVECs (absorbance) Group Experiment Mean±SD 1 2 3 LRG-1 (0 μg/mL) 0.1567 0.1628 0.1618 0.1604±0.0033 LRG-1 (5 μg/mL) 0.1944 0.1828 0.1928 0.1900±0.0063 LRG-1 (10 μg/mL) 0.2040 0.2246 0.2267 0.2184±0.0125 LRG-1 (20 μg/mL) 0.3502 0.3326 0.3327 0.3385±0.0101 LRG-1 (40 μg/mL) 0.4302 0.4234 0.4433 0.4323±0.0101 LRG-1 (50 μg/mL) 0.6155 0.6153 0.6250 0.6186±0.0055 VEGF (10 ng/mL) 0.5278 0.5363 0.5118 0.5253±0.0124 F 1103.012 P 0.000

表 3 LRG-1对HUVEC细胞增殖的影响 Table 3 Effect of LRG-1 on proliferation of HUVECs (absorbance)

图 4(Figure 4)

图 4 LRG-1对HUVEC小管形成的影响 Figure 4 Effect of LRG-1 on tube formation of HUVECs (Original magnification: ×400). A: LRG-1 (50 μg/mL); B: LRG-1 (40 μg/mL); C: LRG-1 (20 μg/mL); D: LRG-1 (10 μg/mL); E: LRG-1 (5 μg/mL); F: Negative control.

1977年Haupt和Baundner从人血清中分离出LRG1，并在1985年又决定了它的氨基酸序列。LRG-1是富亮氨酸重复序列（LRR）家族的一员^[11]，LRRs通常在细胞黏附、生存、信号转导及基因修复、重组、转录等过程中发挥重要作用^[12]。它在骨髓造血时表达，尤其在中性粒细胞系分化时表达较高^[13]。LRG-1在正常人血浆中的浓度为21~50 μg/mL^[14-15]。近年来，有研究发现，LRG-1的异常表达与多种组织恶性肿瘤的发病有关，如肝癌^[4]、胰腺癌^[5]、卵巢癌^[6]、肺癌^[16]和结直肠癌^[8]等，并且LRG-1在这些肿瘤中表达均上调最新研究发现，LRG-1能够促进血管生成，尤其是异常血管的生长^[9]。LRG-1通过结合到其辅助受体endoglin（ENG），从而激活TGF-β血管生成的开关，这使得TGF-β信号远离维持正常血管的信号通路，转向了促进有害血管生成的方向, 活化了促血管生成信号TGF-β R -Ⅱ，进而招募内皮TGF-β R-I激活素受体样激酶-1（ALK-1），而ALK-1反过来又能够启动激活转录因子Smad 1，5和8，从而发挥其促进血管生成的作用^[17]。众所周知，血管生成是一个重要的生物学过程，是发育、生殖以及损伤组织修复的必要条件。然而，异常的血管生成在多种疾病如肿瘤中发挥着重要的作用。以肿瘤中的血管生成为例，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发生、发展以及转移的过程中发挥着极为关键的作用^[18]。以此推测LRG-1在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。

舌癌是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤，有研究表明口腔鳞癌中约为61.4%为舌癌。尽管采用了扩大根治性手术和辅助放射治疗，但治疗效果欠佳，最常见的情况是局部、区域性复发和远处转移。有研究表明舌癌一旦复发，预后很差，3年生存率不足25%^[19]。目前多数学者认为，舌癌的发生、发展与肿瘤细胞中的基因表达调控异常有关。在目前现有的治疗方法基础上，探索安全有效的基因治疗，有望进一步提高口腔鳞癌的综合治疗效果。

本研究发现LRG-1在浸润性舌癌组织及舌癌细胞系Tca8113中呈高表达，在舌部不典型性增生组织及舌原位癌中的表达较浸润性舌癌组织低，LRG-1在浸润性舌癌组织中的表达与患者年龄、性别等不相关，而与组织分化程度、临床分期及淋巴结转移有相关性，组织分化程度越低和临床分期越高的舌癌组织中LRG-1的表达越高，发生淋巴结转移的舌癌组织中LRG-1的表达较未转移的高。Kakisaka等^[5]发现胰腺癌患者血浆中LRG-1浓度较正常人高，故推测LRG-1对胰腺癌的临床诊断有重大意义。Smith等^[6]研究发现女性卵巢癌患者血清及肿瘤组织中LRG-1含量较正常女性高，故推测卵巢癌细胞分泌LRG-1致使卵巢癌患者血清LRG-1浓度升高，进一步的研究将证明LRG-1可能作为诊断卵巢癌的一个生物标志。因此，我们可以得出：LRG-1可能在舌癌的发生过程中发挥重要作用，可作为诊断舌癌的一个辅助指标。本研究还发现，LRG-1能够促进血管内皮细胞的增殖和小管形成，因此可以初步推测LRG-1可能促进血管生成。

综上所述，LRG-1在舌癌组织中表达升高，推测其可作为诊断舌癌的一个辅助指标。LRG1能够促进血管内皮细胞的增殖和小管形成，推测其可能促进肿瘤血管的形成。血管生成在肿瘤的发生、发展及转移的过程中发挥着极为关键的作用，故推测LRG-1在肿瘤的发生、发展中意义重大，具体机制有待于进一步研究。研究舌癌中LRG-1的表达及其生物学作用，可为舌癌的生物治疗提供依据，并为其治疗提供新的靶点。