肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内的多发性肿瘤，也是我国常见的恶性肿瘤，死亡率居我国恶性肿瘤的第2位^[1]。每年约有630 000例肝癌新发病人，其中一半以上发现在中国^[2]。Sirtuin家族是近来发现的依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶^[3]。人类sirtuin家族有7个成员，即SIRT1~7。他们的主要功能有：参与细胞衰老^[4]、凋亡^[5]、分化^[6]、应激^[7]及能量代谢^[8]等。越来越多的证据表明，Sirtuin家族与肿瘤有着密切的联系^[9]。沉默信息调节因子3（SIRT3）是线粒体内主要的去乙酰化酶，广泛分布于成人和胚胎组织。作为一种线粒体蛋白，SIRT3在能量生成^[8]、代谢^[10]、细胞老化^[11]、细胞凋亡^[12]和细胞内信号控制^[13]等方面发挥着重要作用，且其在肿瘤方面的作用也逐渐受到重视。但SIRT3在癌症中的作用倍受争议，曾有文献报道^[14]，SIRT3缺失的小鼠成纤维细胞表现出了线粒体异常，并增加了应激诱导的基因组不稳定性，且细胞易发生癌变。另一些文献报道了，SIRT3在一些癌症中呈现高水平的表达^[15-17]。SIRT3在不同肿瘤进展中的作用不同可能与肿瘤细胞类型和SIRT3在不同信号通路中的作用不同有关。目前，对于SIRT3在肝癌发生发展过程中的作用研究较少，因此明确SIRT3在肝癌细胞增殖中的作用，对进一步深入研究SIRT3对肝癌进展的影响、分析其分子机制、寻找肝癌治疗的分子靶向药物等具有重要的意义。

SK-Hep-1、PLC5、SMCC-7721及MIHA细胞系购于ATCC（American Type Culture Collection）。L02来自Prof.Nathalie Wong（香港中文大学）。pcDNA3.1及SIRT3质粒购于Addgene公司，siRNA购于RIBOBIO公司。SIRT3抗体（#3627）购于Cell Signaling Technology公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购于GE公司。GAPDH及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购于中杉金桥公司。BCA试剂盒购于碧云天公司。逆转录试剂盒FastQuant RT Ki（t with gDNase）购于TIANGEN公司，SYBR Green购于Roche公司。Click-iT EdU Imaging Kits购于Life Technologies，Invitrogen。质粒转染试剂购买自Roche公司。siRNA转染试剂购于QIGEN公司。

以上细胞均培养于含有10% FBS，1% p/s的DMEM培养基中，在含5% CO₂、37 ℃孵箱中常规培养。质粒转染和siRNA转染严格按照试剂说明书操作。

用RIPA裂解液使肝组织及细胞充分裂解，16 000 g离心5 min并取上清于新的EP管中。BCA试剂盒测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样量为30 μg蛋白，将蛋白转至NC膜（RPN303D, GE公司），5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃摇床孵育过夜（SIRT3抗体：BSA=1:3000），二抗室温孵育2 h。以GAPDH为内参。

细胞转染3 d后，提取RNA，逆转录RNA成cDNA，并同时去除基因组DNA，随后使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix进行qPCR，以β-actin为内参。每组实验重复3次。以2^-△△Ct计算目的基因的相对表达水平。

转染后3、4、5 d后进行台盼蓝细胞计数。40 μL细胞悬液加40 μL台盼蓝染液，用枪头吹打混匀后，吸取10 μL加入到计数板内，罗氏自动化细胞计数系统Cedex XS机器读数。并收集细胞以Western blotting进行过表达验证。

转染24 h后换液时，加入含有300 μ/mL G418的新培养基。3孔为pcDNA3.1组，3孔为SIRT3组。每3 d换液1次，细胞长至50%以上，重新传代，3周时观察到明显的集落，进行结晶紫染色。

将SMMC-7721细胞12×10⁴接种于含无菌盖玻片的6孔板中，24 h后转染质粒或siRNA，3 d后运用Click-iT EdUImaging Kits进行EdU标记实验，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，对两样本均数间比较采用配对t检验，多样本间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用两因素方差分析检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

收集正常肝组织2例，提取总蛋白；提取永生化肝细胞MIHA、L02，肝癌细胞SK-Hep-1、SMMC-7721、PLC5的总蛋白。Western blotting检测SIRT3的蛋白表达水平，结果显示SIRT3在肝癌细胞系中的表达量明显低于正常肝组织和永生化肝细胞（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 Western blotting显示SIRT3在正常肝组织、永生化肝细胞、肝癌细胞系中的蛋白表达水平 Figure 1 Expression levels of SIRT3 protein in normal liver tissues, immortalized hepatocyte and HCC cell lines detected by Western blotting.

我们首先在SMMC-7721、PLC5这两种肝癌细胞系中成功的过表达SIRT3，Western blotting检测过表达效率（图 2A）。并在此基础上进行台盼蓝排斥实验，结果显示SIRT3过表达对SMMC-7721细胞增殖的抑制率在第3、4、5天分别为61%、59%、53%（图 2B，P < 0.05）；SIRT3过表达对PLC5细胞增殖的抑制率在第3、4、5天分别为59%、51%、54%（图 2B，P < 0.05）；同时，我们在SMMC-7721上进行了EdU标记实验，结果显示过表达SIRT3使肝癌细胞中的DNA合成能力较对照组下降了57%（图 2C，P < 0.05）。揭示SIRT3过表达明显抑制了肝癌细胞增殖。

图 2(Figure 2)

图 2 SIRT3过表达对肝癌细胞增殖的影响 Figure 2 Effect of SIRT3 overexpression on proliferation of HCC cells. A: Western blotting for detecting overexpression of SIRT3 in transfected SMMC-7721 and PLC5 cells; B: Trypan blue exclusion experiment showing the changes in proliferation of SMMC-7721 and PLC5 cells following the transfection. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group. C: Effect of SIRT3 overexpression on DNA synthesis of SMMC-7721 cells tested by EdU incorporation assay. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group.

在SMMC-7721中过表达SIRT3，并以0.2 μmol/L嘌呤霉素处理培养2周，结晶紫染色。结果显示与pcDNA3.1组相比，SIRT3过表达组中肝癌细胞集落数目明显降低，提示着SIRT3过表达可显著抑制肝癌细胞的集落形成能力（图 3）

图 3(Figure 3)

图 3 集落形成实验检测过表达SIRT3对肝癌细胞集落形成能力的影响 Figure 3 Colony-forming assay of HCC cells overexpressing SIRT3.

我们首先在SMMC-7721细胞中转染了靶向沉默SIRT3的siRNA和siCont，qRT-PCR证实SIRT3的沉默是有效的（图 4A），siSIRT3-1的沉默效率约为65%（P < 0.05），siSIRT3-2的沉默效率约为70%（P < 0.01）。在SIRT3沉默的基础上，通过台盼蓝排斥实验分析发现转染siSIRT3-1使SMMC-7721细胞增殖在第3、4、5天分别增加了59% 、61% 、61%（图 4B，P < 0.01），转染siSIRT3-2使SMMC-7721细胞增殖在第3、4、5天分别增加了55%、51%、53%（图 4B，P < 0.01），同时，通过EdU标记实验检测也发现siSIRT3-1、siSIRT3-2使SMMC-7721细胞的DNA合成能力分别增加了137%、149%，揭示着SIRT3沉默明显促进了SMMC-7721中的DNA合成能力（图 4C，P < 0.01）。这些结果证实SIRT3沉默可以明显促进肝癌细胞增殖。

图 4(Figure 4)

图 4 SIRT3沉默对肝癌细胞增殖的影响 Figure 4 Effect of SIRT3 knockdown on HCC cell proliferation. A: QRT-PCR for detecting the knockdown efficiency of SIRT3. *P<0.05, **P< 0.01 vs siCont group; B: Effect of SIRT3 knockdown on SMMC-7721 cell proliferation. **P<0.01 vs siCont group; C: Effect of SIRT3 knockdown on DNA synthesis in SMMC-7721 cells. **P<0.01 vs siCont group.

近年来，SIRT3的作用逐渐受到人们的关注，SIRT3通过去乙酰化SOD2的2个关键的赖氨酸残基，促进了SOD2的抗氧化活性^[18]，SIRT3也能够去乙酰化MnSOD赖氨酸122，诱导其活性^[19]，从而调节了细胞氧化应激反应。有研究表明^[20]SIRT3通过去乙酰化Ku，促进Ku70-Bax的相互作用，调节了细胞凋亡。也有文献报道^[21]SIRT3抑制P53的活性，参与了细胞周期和老化的调节。此外，SIRT3能调节肿瘤发生的不同进程，如细胞能量代谢失控，基因组不稳定性增加，促肿瘤炎症反应等，并在一些肿瘤中起着双重调节的作用，对口腔癌、纤维肉瘤、宫颈癌、淋巴结阳性的乳腺癌、膀胱癌，SIRT3起促进肿瘤发生的作用，而在结肠癌、骨肉瘤、早期乳腺癌、白血病中，起抑制肿瘤发生的作用^[22]。因此，SIRT3在不同的肿瘤组织中有着不同的功能，这种功能具有细胞和肿瘤特异性。而目前有关于SIRT3在肝癌中的报道还很少。

本研究表明，SIRT3在肝癌细胞系中的表达量明显低于正常肝组织及永生化肝细胞。而在过表达SIRT3后，台盼蓝排斥实验检测明显观察到肝癌细胞的生长受到了抑制。EdU标记实验检测显示过表达SIRT3使得肝癌细胞的DNA合成能力显著减弱，进一步提示了SIRT3可抑制肝癌细胞的增殖。此外，平板集落实验显示过表达SIRT3可显著减弱肝癌细胞的集落形成能力。最后，我们在肝癌细胞中沉默SIRT3后发现肝癌细胞的增殖能力和DNA合成能力都显著增强。目前许多研究关注于SIRT3对不同肿瘤细胞增殖作用的机制研究，在胃癌进展中，SIRT3通过下调Notch-1的表达抑制了胃癌细胞增殖^[23]；在胰腺肿瘤发生中，SIRT3通过调节GOT2的乙酰化状态，抑制了细胞氧化应激反应，促进了胰腺肿瘤细胞增殖^[24]；在非小细胞肺癌发展中，SIRT3去乙酰化NMNA2，调节了细胞能量代谢，有利于细胞增殖^[25]。从这些报道中发现SIRT3通过不同的信号通路对肿瘤细胞增殖有着不同的调节作用，下一步我们也将从氧化应激反应、能量代谢、凋亡等方面研究SIRT3影响肝癌细胞增殖的分子机制。肿瘤的发生是一个多基因、多步骤的过程，其中恶性增殖能力是肿瘤细胞的重要表型。我们从SIRT3过表达和沉默两个方面证实了SIRT3可抑制肝癌的增殖。因此，本研究对明确SIRT3对肝癌发生发展的作用，鉴定新的治疗肝癌的分子药物靶点具有重要的意义。