日光照射是引起皮肤结构和功能老化改变的主要因素。日光中的紫外线（UV）目前被公认为是诱导光老化的重要因素^[1-2]，这已被大量临床实验研究充分证明。然而，流行病学数据和临床观察表明：红外线（IR）辐射不能被认为对人类皮肤完全无害^[3]。红外线辐射与紫外线辐射相似，能够导致和加快皮肤光化性损伤的发生，如早衰和致癌作用^[4]。以往研究发现近红外线（IR-A）辐射改变了人皮肤中HSF的基因转录^[5]。这些基因大幅上调了HSF中基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达，引起胶原纤维降解，最终导致皱纹形成^[6]。近年来的研究表明，高剂量IR-A辐射会对人类皮肤产生病理影响，IR-A辐射引起皮肤发生氧化应激反应，引起线粒体活性氧和自由基的生成^[7]，启动不同的信号级联通路，破坏真皮细胞外基质结构蛋白，引发皮肤过早老化^[8]。但目前国内外对红外线引起皮肤光老化的研究仍然较少，其分子机制仍处于未知阶段。因此，我们通过本研究进一步阐明红外线诱导皮肤光老化可能的形成机制，为预防皮肤光老化及开发新的防光老化产品提供新思路。

主要试剂：c-Jun抗体（Millipore, USA）、DMEM培养基及胎牛血清（HyClone, USA）、MTT（Thermo electron, USA）、Real time-PCR引物（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）、Ⅰ，Ⅲ型胶原兔抗体及免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）、Vimentin抗体（ImmunoWay, USA）、PrimeScript^®; RT reagent Kit（Takara, 中国）。主要仪器：倒置及正置显微镜（OLYMPUS, Japan）、CO₂培养箱（Heraeus, Germany）、高速冷冻离心机（Eppendorf, Germany）、红外线仪（重庆华伦弘历实业有限公司）、全波长酶标仪（Thermo electron, USA）Real time-PCR仪（ABI, USA）。

取3名8~10岁的健康儿童的包皮组织，按照组织块贴壁法进行原代培养，培养成功后通过形态学观察、HE染色及免疫组化进行鉴定，并传代培养^[9-10]，第3~6代细胞用于实验。

（1）实验分组：实验组接受红外线照射，照射时间参考临床治疗时间（红外线仪，波长0.78~2.8 μm，功率100 W），红外线照射时间分别为10、20、30 min，细胞接受照射后继续培养12或24 h，分为6组，即为10 min~12 h组（红外线照射10 min后细胞继续培养12 h，其余组以此类推，红外线照射10、20、30 min相当于照射剂量为60 000、120 000、180 000 J），20 min~12 h组，30 min~12 h组；10 min~24 h组（红外线照射10 min后细胞继续培养24 h，其余组以此类推），20 min~24 h组，30 min~24 h组。对照组除无红外线照射外，其培养时间及条件与实验组相同；（2）样品制备：用胰酶消化对数生长期的HSF，用完全培养基调整细胞密度为1×10⁵/孔HSF，接种于24或96孔板或培养瓶中，5% CO₂的37 ℃培养箱中常规培养。待细胞长至80%左右融合时，分为对照组1个和实验组6个（包括10 min~12 h、20 min~12 h、30 min~12 h、10 min~24 h、20 min~24 h和30 min~24 h组），每次共7组，实验独立重复3次。将培养瓶或培养板置于距离红外线仪25 cm的平面进行照射，照射时间分别为10、20和30 min，照射结束后立即弃掉PBS加入完全培养基继续培养12 h或24 h后收集细胞备用。对照组除未给予红外线照射外，其余与实验组处理相同。

将上述7组96孔板细胞每孔中加入浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL，放入含有5% CO₂的37 ℃培养箱中继续培养4 h，终止培养，弃去培养板中每孔上清液后加入150 μL DMSO，震荡10 min，选择490 nm的波长，在酶标仪上测定每孔的吸光值（A值），按照下列公式计算细胞生长抑制率（%）=（实验组A值-对照组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%，细胞存活率=1-细胞生长抑制率（%），计算细胞的存活情况。

细胞爬片：将细胞悬液滴到铺有盖玻片的24孔板中，每孔中加入1 mL细胞悬液，放于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，培养24 h后实验组按上述分组进行红外线照射，对照组不作处理。常规细胞固定后进行HE染色，显微镜下观察并取图。

（1）细胞爬片及固定方法同HE染色；（2）c-Jun，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Vimentin（波形蛋白）抗体一抗工作浓度分别为：1:200、1:50、1:100及1:100），阴性对照用PBS代替一抗。免疫组化操作按免疫组化染色试剂盒说明进行。

（1）按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明提取总RNA；（2）按照PrimeScript^®; RT reagent Kit反转录试剂盒说明进行逆转录反应；（3）Real time-PCR过程根据GeneBank中c-Jun、Ⅰ型胶原（COL-1）和Ⅲ型胶原（COL-3）基因序列，以GAPDH为内参基因，设计、合成引物。c-Jun引物：上游引物5'-CCAAGAACTCGGAC CTCC-3'，下游引物5'-GAAGCCCTCCTGCTCATC-3'，长度167 bp；COL-1引物：上游引物5'-TGG AATGAAGGGACACAGAG-3'，下游引物5'-CAG GGCGACCTCTCTCAC-3'，长度155 bp；COL-3引物：上游引物5'-CCTGGTCCTCCTGGTAGT-3'，下游引物5'-TCCCTTCTCTCCTGGTTG-3'，长度159 bp；GAPDH引物：上游引物5'-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3'，下游引物5'-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'，长度>175 bp。进行实时定量PCR反应，95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，共45个循环。每个标本的各个指标均做3个重复管，取平均Ct值，以管家基因GAPDH为内参基因，采用相对定量法，利用Ct值计算目的基因的相对表达含量，相对表达量=2^-△△Ct。

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差表达，计量资料用方差分析检验多组之间的显著性差异，P < 0.05认为差异有统计学意义。采用χ²分析方法对ICC结果进行比较，P < 0.05认为有统计学显著性差异。

通过形态学、HE染色和波形蛋白免疫细胞化学染色3种方法，证明我们从人包皮中提取、分离和培养的是皮肤成纤维细胞（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 原代人皮肤成纤维细胞鉴定图 Figure 1 Primary culture of human skin fibroblasts. A: Phase-contrast microscopy (Original magnification: ×10); B: HE staining(×20); C: Immunocytochemistry for vimentin showing brown granules in the cytoplasm(×20).

运用MTT的方法，观察IR照射对HSF增殖情况的影响（图 2）。MTT结果显示：（A）图中IR照射HSF后继续培养12 h测其A值，计算细胞存活率，随着IR照射剂量的增加细胞存活率越来越低，与正常组相比，10 min~12 h组HSF存活率无显著性差异（P < 0.05），而20 min~12 h和30 min~12 h组HSF存活率差异有显著性差异（P < 0.01）；（B）图中IR照射HSF后继续培养24 h测其A值，计算细胞存活率，随着IR照射剂量的增加细胞存活率越来越低，与正常组相比，10 min~24 h组HSF存活率无显著性差异（P < 0.05），而20 min~24 h和30 min~24 h组HSF存活率差异有显著性差异（P < 0.01），以上结果表明：HSF的增殖能力随着IR照射剂量的增加逐渐减弱。

图 2(Figure 2)

图 2 不同IR照射剂量照射HSF后12 h和24 h细胞存活率 Figure 2 Cell survival rate of HSFs exposed to different doses of IR irradiation for12 h(A) and24 h(B) (Mean±SD, n=6). ##P < 0.01 vs control group.

c-Jun在细胞核表达，以细胞核出现棕黄色颗粒或呈棕黄色作为阳性细胞，Ⅰ、Ⅲ型胶原（COL-1、COL-3）在细胞质表达，以细胞胞质出现棕黄色颗粒或呈棕黄色作为阳性细胞。随机观察5个高倍视野，按照如下方法对ICC结果进行判断比较，细胞阳性着色程度：无色为0分，浅黄色（+）为1分，棕黄色（++）为2分，棕褐色（+++）为3分，染色强度需与背景着色相对比；依照阳性细胞数量：0分为阴性，1分为阳性细胞 < 25%，2分为25%~50%，3分为 > 50%。将上述两项得分相加得出评分结果：≤1分为阴性，2分为弱阳性（+），3~4分为阳性（++），≥5分为强阳性（+++），弱阳性及以上视为阳性表达，对结果进行卡方统计分析。

在正常情况下c-Jun不表达或低表达，当受到外界刺激后其表达会发生变化。c-Jun的ICC结果显示：HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h和24 h后c-Jun蛋白表达均有升高，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.01），c-Jun蛋白表达随着IR照射剂量的增加逐渐升高（表 1，图 3）。

表 1(Table 1)

表 1 c-Jun在IR照射组和对照组的表达情况 Table 1 Expression of c-Jun in IR irradiation group and control group Group Negative Positive x2 P Control 78 23 - - 10 min-12 h 45 20 1.318 0.25 20 min-12 h 47 39 10.68 < 0.01 30 min-12 h 32 60 35.39 < 0.01 10 min-24 h 67 36 3.680 0.06 20 min-24 h 38 33 10.67 < 0.01 30 min-24 h 31 56 33.19 < 0.01

表 1 c-Jun在IR照射组和对照组的表达情况 Table 1 Expression of c-Jun in IR irradiation group and control group

图 3(Figure 3)

图 3 c-Jun在IR照射组和对照组的表达情况 Figure 3 Expression of c-Jun in the IR-irradiated cells and control cells(Original magnification: ×40). A: 10 min-12 h; B: 20 min-12 h; C: 30 min-12 h; D: 10 min-24 h; E: 20 min-24 h; F: 30 min-24 h; G: Control.

在正常情况下成纤维细胞能够表达Ⅰ型胶原（COL-1），当受到外界刺激后其表达会发生改变。COL-1的ICC结果显示：HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h和24 h后COL-1表达均有下降，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.01），COL-1表达随着IR照射剂量的增加逐渐下降（表 2，图 4）。

表 2(Table 2)

表 2 COL-1在IR照射组和对照组的表达情况 Table 2 Expression of collagen I in IR-irradiated cells and control cells Group Negative Positive x2 P Control 26 71 - - 10 min-12 h 32 62 1.183 0.28 20 min-12 h 44 50 8.228 < 0.01 30 min-12 h 61 35 26.30 < 0.01 10 min-24 h 35 64 1.671 0.20 20 min-24 h 39 40 9.516 < 0.01 30 min-24 h 53 28 24.48 < 0.01

表 2 COL-1在IR照射组和对照组的表达情况 Table 2 Expression of collagen I in IR-irradiated cells and control cells

图 4(Figure 4)

图 4 COL-1在IR照射组和对照组的表达情况 Figure 4 Expression of collagen I in IR-irradiated cells and control cells(Original magnification: ×40). A: 10 min-12 h; B: 20 min-12 h; C: 30 min-12 h; D: 10 min-24 h; E: 20 min-24 h; F: 30 min-24 h; G: Control.

在正常情况下成纤维细胞能够表达Ⅲ型胶原（COL-3），当受到外界刺激后其表达发生改变。COL-3的ICC结果显示：HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h后COL-3表达均有下降，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.05或P < 0.01），但在照射24 h后COL-3表达随着IR照射剂量的增加逐渐升高，与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.05，表 3，图 5）。

表 3(Table 3)

表 3 COL-3在IR照射组和对照组的表达情况 Table 3 Expression of collagen III in IR-irradiated cells and control cells Group Negative Positive x2 P Control 34 52 - - 10 min-12 h 29 41 0.057 0.81 20 min-12 h 57 44 5.311 0.02 30 min-12 h 61 37 9.459 < 0.01 10 min-24 h 30 73 2.267 0.13 20 min-24 h 22 70 5.031 0.03 30 min-24 h 19 64 5.435 0.02

表 3 COL-3在IR照射组和对照组的表达情况 Table 3 Expression of collagen III in IR-irradiated cells and control cells

图 5(Figure 5)

图 5 COL-3在IR照射组和对照组的表达情况 Figure 5 Expression of collagen III in IR-irradiated cells and control cells(Original magnification: ×40). A: 10 min-12 h; B: 20 min-12 h; C: 30 min-12 h; D: 10 min-24 h; E: 20 min-24 h; F: 30 min-24 h; G: Control.

HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h和24 h后c-Jun mRNA均有升高，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.05或P < 0.01），c-Jun mRNA表达随着IR照射剂量的增加逐渐增高，且IR照射后12 h HSF的c-Jun mRNA表达升高最明显（图 6）。

图 6(Figure 6)

图 6 IR照射HSF后12 h和 24 h c-Jun mRNA的表达水平 Figure 6 c-Jun mRNA expression level in HSFs exposed to IR irradiation for12 h(A) and24 h(B) (Mean±SD, n=3). #P < 0.05 vs control group; ##P < 0.01 vs control group.

HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h和24 h后COL-1 mRNA均有下降，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.01），COL-1 mRNA表达随着IR照射剂量的增加逐渐增高，且IR照射后24 h HSF的COL-1 mRNA表达降低最明显（图 7）。

图 7(Figure 7)

图 7 IR照射HSF后12 h和24 h COL-1 mRNA的表达水平 Figure 7 Collagen I mRNA expression level in HSFs exposed to IR irradiation for 12 h(A) and 24 h(B) (Mean±SD, n=3). ##P < 0.01 vs control group.

HSF接受3种不同剂量的IR照射，在照射后12 h后COL-3 mRNA均有下降，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.01），而在IR照射后24 h后COL-3 mRNA表达随着照射剂量的增加逐渐上升，照射20 min和30 min组与对照组相比，有显著性差异（P < 0.05或P < 0.01，图 8）。

图 8(Figure 8)

图 8 IR照射HSF后12 h和24 h COL-3 mRNA的表达水平 Figure 8 Collagen III mRNA expression level in HSFs exposed to IR irradiation for12 h(A) and24 h(B) (Mean±SD, n=3). #P < 0.05 vs control group; ##P < 0.01 vs control group.

皮肤光老化表现为皮肤皱纹、下垂，松弛和色素沉着等。胶原蛋白和弹性蛋白维持皮肤的强度和弹性，它们的异常会引起明显的皮肤退行性改变，导致老化皮肤的出现^[11-12]。皮肤光老化的形成不仅与UV辐射^[13]有关，也与波长更长的IR辐射有关，IR破坏胶原蛋白代谢平衡，增加导致胶原蛋白降解的MMP-1的表达，并减少胶原蛋白本身的从头合成^[14]。

IR产生热，增加受阳光照射皮肤的温度。Cho^[15]发现，IR产生的热能引起热休克，增加人体MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白的表达水平，并快速激活MAPKs信号通路，引起I型胶原降解。Lan^[16]发现热可增加真皮成纤维细胞中MMP-1和MMP-3 mRNA的表达，降低抗氧化酶活性，导致结缔组织降解。Schroeder^[5]发现IR诱导MMP-1表达上调，而MMP-1的抑制剂TIMP-1表达并没有增加，从而导致胶原蛋白的降解。而长期IR照射无毛小鼠诱发皱纹形成，并增强UV诱导的无毛小鼠皱纹形成和皮肤增厚。IR治疗增加UV诱导的真皮胶原蛋白和弹性纤维降解^[17]。从这些结果，证明IR可单独诱发皮肤皱纹形成，也可增强UV诱导的皱纹形成。

我们的研究结果表明，IR照射成纤维细胞导致Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达水平下降，并随着IR照射剂量的增加下降越明显，在IR照射后12 h和24 h这两个时间点的Ⅰ型胶原的表达逐渐下降，而在照射剂量为30 min的24 h这个时间点Ⅰ型胶原的表达下降最明显。Schroeder^[18]研究发现IR辐射抑制Ⅰ型胶原合成，这与我们的研究结果是一致的，而Kim^[19]却发现，IR刺激成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白，有益于改善皮肤的纹理和皱纹，可以用来治疗皮肤光老化，这可能与活体细胞和培养细胞对IR的吸收能力不同有关，主要可能与选用的IR波长及照射时间不同有关，本实验所用红外线仪波长为0.78~2.8 μm，接近日光中的红外线波长，有利于模拟日常生活中人体接收到的红外线照射，更真实的反应日光中的红外线对人体皮肤成纤维细胞的作用。

本研究发现，在IR照射成纤维细胞后12 h，Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达水平下降，并随着IR照射剂量的增加下降越明显，有趣的是，在24 h后Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达水平却出现升高，IR照射剂量越大升高越明显，这可能由于IR照射成纤维细胞引起炎症反应，导致Ⅲ型胶原合成增高。Ⅲ型胶原是幼稚、纤细的胶原纤维，Ⅰ型胶原合成减少，Ⅲ型胶原表达增加，二者比例失调^[20]，最终引起成熟的胶原纤维形成减少，导致皮肤出现松弛和皱纹等光老化外观。

在UV辐射对人皮肤影响的研究中，有证据表明，I型前胶原表达主要受转录过程调节，AP-1，是c-Jun和c-fos组成的蛋白质，负性调节I型前胶原基因转录^[21]。UV辐照迅速上调人体皮肤内AP-1的表达，AP-1的增高主要表现为c-Jun表达的增加。在UV照射人体皮肤后24 h内c-Jun最大限度地提高，这种c-Jun持续性增高与观察到的前胶原基因表达持续性降低是一致的，Quan等^[22]研究发现c-Jun对UV辐射原代人皮肤成纤维细胞中Ⅰ型前胶原基因表达起抑制作用。Wang和Park等^[23-24]发现UV辐射诱导皮肤成纤维细胞中c-Jun快速表达，抑制内源性Ⅰ型和Ⅲ型前胶原基因表达，UV上调c-Jun表达和抑制Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达的趋势是一致的。

我们研究发现IR与UV类似，IR照射成纤维细胞后c-Jun蛋白和mRNA表达均有升高，并随着IR照射剂量增加升高越明显，在IR照射后12 h和24 h这两个时间点c-Jun mRNA表达均有升高趋势，而在IR照射后12 h中c-Jun mRNA表达的增高最明显，其中30 min~12 h的c-Jun mRNA表达量是正常组的7倍，该结果与Kim^[9]的动物实验结果有类似之处。本实验中，IR诱导c-Jun增高的趋势和Ⅰ型胶原降低的趋势一致，推测IR可能通过诱导c-Jun表达，抑制Ⅰ型胶原表达来促进皮肤光老化的发生。IR照射后Ⅲ型胶原表达先降低后又升高，而与c-Jun表达增高的趋势不同，Ⅲ型胶原表达先降低可能c-Jun表达增高有关，Ⅲ型胶原表达又升高可能与IR照射成纤维细胞后引起炎症反应有关。

综上所述，IR照射人皮肤成纤维细胞可能通过诱导c-Jun表达，抑制Ⅰ型胶原，扰乱Ⅲ型胶原，导致I型胶原和Ⅲ型胶原比例失调，引起皮肤光老化的发生。但IR引起皮肤光老化的具体分子机制，信号通路及上下游转录因子的调控机制，还有待进一步去研究发现。