天门冬酰胺酶（AN）是一种具有显著抗肿瘤作用的酶制剂^[1]。AN通过降解天门冬酰胺来抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，从而使肿瘤细胞死亡^[2]。但AN在临床应用上存在着生物半衰期短、易被降解、稳定性差等缺点^[3]，一定程度上限制了AN的临床应用。

目前，文献^[4-5]报道的自组装空心纳米囊是一种新型的药物载体，其空心结构可封装酶、小分子药物、基因等，它具有生物膜的相似性，能提高封装药物的稳定性，延长被封装药物的生物半衰期，提高封装药物的生物利用度以及降低毒副作用等特点。

透明质酸（HA）与mPEG可通过酰胺键相互连接，形成透明质酸-聚乙二醇（HA-g-PEG）分子链；磺丁基-b-环糊精（SCD）分子可呈棒状嵌入HA链并在HA链上平行堆积；SCD分子链与mPEG链形成空心纳米囊，从而将AN封装在其空心结构中^[5-7]。本实验依据上述思路，制备了AHSPs，并考察了AHSPs 的透射电镜、粒径、Zeta电位以及AHSPs在大鼠体内的药代动力学和生物等效性。另外，本文作者尚未见任何关于AHSPs的研究报道。

AN（以色列Prospec）；AHSPs（实验室自制，批号：20141013；20141017；20141022）；Tris-HCl 缓冲液，50 mmol/L，pH 7.3（实验室自配）；其它试剂均为分析纯。

Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore）；pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；ZetasizerNano zs90 激光粒度电位仪（英国马尔文公司）；UV-7504 PC紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）。

清洁级健康SD大鼠，雄性，体质量250±20 g（由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（渝）2014-0001）。

称取HA-g-PEG 1.0 g 和SCD6.0 g，分别加Tris-HCl 缓冲液（pH 7.3）溶解并定容至100 mL。将5 mg的AN溶于HA-g-PEG溶液后，于搅拌条件下缓慢加至SCD溶液30 mL中，搅拌2 h，即得AHSPs^[5-7]，批号（20141013；20141017；20141022）。

取AHSPs 0.5 mL，用Tris-HCl缓冲液稀释10倍后，在透射电镜下观察AHSPs的形态。

使用马尔文粒度仪检测AHSPs 的粒径和Zeta 电位。取AHSPs 溶液0.5 mL，加入Tris-HCl 缓冲液稀释10倍后，测其粒径和ζ电位。

AN活性的测定参照马斯本-利斯通法^{[6, 8]}测定AN的活性。改进：实验前样品预热2 min。

将12只雄性SD大鼠随机分为2组，每组6只。分别尾静脉注射给予AHSPs和游离AN，剂量均为2.0 kU/kg。给药前禁食24 h。

分别在给药后0.08、0.17、0.25、0.50 、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h眼底静脉丛取血。采血置于肝素化后的试管，以3000 r/min离心10 min后分离血浆样品，按“1.2.4 AN活性的测定”项下方法进行活性测定，计算血浆样品中AN的活性，进行AHRPs的药动学研究。

根据所测结果，绘制平均血药浓度-时间曲线。用DAS 2.1.1软件计算药代动力学参数。

将AHSPs和游离AN的主要药代动力学参数AUC_{（0~48 h）}、AUC_（0-∞）及C_max进行方差分析，再采用双向单侧t检验（显著性水平P=0.05），90%可信限考察，Tmax采用非参数统计Wilcoxon检验。评价AHSPs和游离AN是否具有生物等效性（α=0.05）。

如图 1 所示，透射电镜下观察到AHSPs呈均匀分布的圆形或椭圆形，分散均匀，无黏连，且AHSPs粒径约为400 nm。

图 1(Figure 1)

图 1 AHSPs的透射电镜图 Figure 1 Transmission electron microscopy ofAHSPs (×250 000).

测得AHSPs的平均粒径为413.80±10.97 nm，电位为-20.37±2.38 mV。AHSPs的粒径分布和电位见图 2。

图 2(Figure 2)

图 2 AHSPs的粒径分布图（A）和zeta点位分布图（B） Figure 2 Size distribution (A) and zeta potential (B) of AHSPs.

以时间为横坐标，平均血药浓度为纵坐标，建立AN在大鼠体内AHSPs和游离AN的药-时曲线见图 3。AHSPs和游离AN在SD大鼠体内的药代动力学参数见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 SD大鼠静脉注射AHSPs和游离AN后的主要药动学参数 Table 1 Main pharmacoinetic parameters of intravenously injectedAHSPs and free AN in rats (Mean±SD, n=6) Parameter AHSPs AN AUC(0-48h)(U/mL*h) 137.34±1.82 46.38±1.98 AUC(0-∞)(U/mL*h) 164.66±6.88 51.44±3.01 Cmax(U/mL) 29.95±0.24 26.06±0.88 t1/2 (h) 4.62±0.60 1.86±0.38

表 1 SD大鼠静脉注射AHSPs和游离AN后的主要药动学参数 Table 1 Main pharmacoinetic parameters of intravenously injectedAHSPs and free AN in rats (Mean±SD, n=6)

如图 3所示，大鼠静脉注射游离AN后，AN失活较快，6 h 时几乎完全失活，8 h 时完全失活，活性降为0。而同等条件下，大鼠静脉注射AHSPs后，由于AHSPs的包裹，AN失活较慢，6 h时仍有较高活性，20 h时仍有一定活性，直至24 h 时活性才完全消失。结果表明，AHSPs不仅延长了AN在大鼠体内的滞留时间，还提高了AN在大鼠体内的稳定性。

图 3(Figure 3)

图 3 大鼠静脉给予AHSPs和游离AN后的平均血药浓度-时间曲线 Figure 3 Mean concentration-time curve of AHSPs and freeasparaginase (AN) after intravenous administration in rats (n=6).

由表 2 参数可以看出：（1）AHSPs 的半衰期t_1/2为4.62±0.60 h，游离AN的为1.86±0.38 h，AHSPs的t_1/2为游离AN的2.48倍，说明AHSPs消除较慢，能有效延长AN在大鼠体内生物半衰期；（2）AHSPs 的AUC_{（0~48 h）}为164.66±6.88 U/mL*h，游离AN的为46.38±1.98 U/mL^*h，AHSPs的AUC_{（0~48 h）}是游离AN的2.96 倍，说明AHSPs显著提高了游离AN的生物利用度；（3）AHSPs的AUC_{（0~ ∞）}为164.66 ± 6.88 U/mL^*h，游离AN 的为51.44±3.01 U/mL^*h，AHSPs 的AUC_{（0~ ∞）}是游离AN的3.20倍，说明AHSPs显著提高了游离AN的生物利用度。

表 2(Table 2)

表 2 大鼠静注注射(2 kU/kg，i.v.) AHSPs和游离AN后生物等效性的比较 Table 2 Assessment of bioequivalence between intravenously injected AHSPs and 2 kU/kgfree AN (n=6) Parameter 90% Confidence interval Bioequivalence standard P AUC(0-48 h) 75.0%-76.5% 80%-125% - AUC(0-∞) 74.3%-76.1% 80%-125% - Cmax 95.1%-96.7% 70%-143% - Tmax ＜0.05

表 2 大鼠静注注射(2 kU/kg，i.v.) AHSPs和游离AN后生物等效性的比较 Table 2 Assessment of bioequivalence between intravenously injected AHSPs and 2 kU/kgfree AN (n=6)

DAS2.1.1 软件处理，得出AHSPs 与游离AN 的AUC_{（0~48 h）}的90%可置信区间为75.0%~76.5%，生物等效性标准区间为80%~125%；AUC_（0~∞）的90%可置信区间为74.3%~76.1%，生物等效性标准区间为80%~125%；Cmax 90%可置信区间为95.1%~96.7%；生物等效性标准区间为70%~143%。由实验结果可以看出，AHSPs与游离AN的AUC_{（0~48 h）}、AUC_（0~∞）和Cmax三个参数的90%可置信区间均不在生物等效性标准区间范围内，因此AHSPs与游离AN不具有生物等效性。另外，对Tmax进行非参数法检验，结果显示AHSPs和游离AN的Tmax具有显著性差异（P＜0.05）。按照生物等效性的判定标准，AHSPs与游离AN不具有生物等效性。

AN在临床应用上存在生物半衰期短、稳定性差和毒副作用等缺点。目前，针对AN的缺点，国内外已进行了下列研究：（1）聚乙二醇对AN进行物理包埋或修饰^[11-12]；（2）制备纳米结构AN脂肪酸生物共轭体^[13]；（3）将AN共价结合固定化于丝素纳米颗粒^[14]等。而郭青龙等^[15-16]报道的将游离AN制备成前体脂质体包裹，可明显降低AN对小鼠的急性毒性和副作用。但以上对AN的改善方法都不能使AN发挥其最优的催化活性，且大都会存在较低的生物相容性、较差的稳定性及AN易脱落等缺点。

故本实验首次采用自组装法成功制备了AHSPs，并对AHSPs在大鼠体内的药代动力学和生物等效性进行了研究，以期能提高AN在大鼠体内的稳定性，延长AN的生物半衰期，并提高其生物利用度。实验结果显示，将AN制成AHSPs，与游离AN比较，AHSPs 的AUC_{（0~48 h）}、AUC_{（0~ ∞）}和t_1/2分别提高了2.96、3.20 和2.48倍。说明AHSPs提高了AN在体内的生物利用度和稳定性，并延长了AN在体内的生物半衰期。可能的原因是：（1）该纳米囊材料具有生物相似性，能有效提高AN的吸收；（2）空心纳米囊结构，能阻挡抗胰蛋白水解酶及抗原与AN的接触，使AN不易被体内蛋白酶水解和吞噬细胞消除，因此在一定程度上能增强AN的稳定性；（3）HA-g-PEG 中链接的mPEG分子在改善载体材料的特性的同时，还避免了载体被网状内皮系统摄取^[17-18]，增加AN在体内的循环时间，提高AN在体内的生物利用度。

且根据生物等效性判断标准，AHSPs与游离AN具有生物不等效性，即AHSPs的药效学标准明显比游离AN的高。本文首次制备AHSPs，且对其在大鼠体内的药代动力学和生物等效性进行了研究，故具有一定的前瞻性，也为AN在临床上的进一步应用奠定了基础。