高迁移率族蛋白B1（HMGB1）不仅是一种重要的晚期炎症介质，还具有调节机体免疫的功能，在炎症反应及肿瘤发展机制方面具有重要作用^[1-2]。应用抗HMGB1抗体进行被动免疫治疗，对严重内毒素血症、脓毒症、关节炎以及LPS诱导的急性肺损伤都有积极的治疗作用^[3]。即使抗体应用时机较晚，肿瘤坏死因子水平已恢复正常，抗HMGB1抗体仍可显著改善症状和预后。如何进一步明确HMGB1的合成释放调控机制，对于寻找针对脓毒症、肿瘤免疫调控等方面的治疗策略具有重要意义。

研究显示，活化T细胞核因子2（NFAT2）是淋巴细胞内关键的转录调控因子，被T细胞受体（TCR）信号活化后，转位入核内调控免疫因子转录表达，属于经典的免疫调节蛋白^[4]，NFAT蛋白在静息状态下位于T淋巴细胞胞浆中，高度磷酸化，活化时被钙调蛋白依赖性磷酸酯酶（calcineurin）作用而发生去磷酸化，移位入细胞核，调节诸如IL-4、IL-2、IL-5、IL-13、GM-CSF、IL-3、TNF-α等重要免疫分子的表达^[5-7]。既往资料显示^[8]，HMGB1与NFAT2存在一些共同的相互作用蛋白，二者有可能形成蛋白复合体。已证实^[9]，HMGB1可作为雌激素受体-α（estrogen receptor-α,ER）的共激活蛋白促进雌激素受体的转录活性。ER转录的关键步骤在于ER与雌激素反应元件（ERE）结合，从而启动下游基因转录表达。HMGB1蛋白可以显著促进ER与ERE的结合。另一方面，军事医学科学院的叶棋浓教授^[10]研究表明，NFAT家族成员可与ER直接结合并相互影响信号通路。因此，有理由推测HMGB1可能与NFAT发生直接相互作用。另有资料表明^[11]，一种HMGB1/2 家族中DNA结合蛋白成员——DSP1（DSP1中含有与HMG序列相似的结构域），可与Rel同源域家族成员发生相互作用。而NFATs结构中含有Rel相似结构域（Rel similardomain,RSD），结构上的特点提示二者可能直接相互作用。

研究发现，HMGB1可促进NFAT2参与调控白介素-2的转录表达^[12]。HMGB1为非组蛋白DNA调节蛋白，可进入细胞核内参与基因的调控，但目前对于NFAT2对HMGB1的影响机制尚缺乏研究。本实验构建NFAT2和HMGB1的真核表达质粒，观察NFAT2对HMGB1释放的影响，初步揭示NFAT2对HMGB1的调控作用。

人全长PSH140C-Flag-NFATC1（NM_006162.3）质粒由华盛顿大学Feng Chen博士惠赠。NFAT2的基因全长序列在GenBank中基因登录号为U08015，其开放读码框从240 到2390 位^[13]；在Medline 的GenBank 数据库中获取人HMGB1 的基因全长序列，基因库登录号为BC066889，其开放读码框从80到727位。

NFAT2 及HMGB1 的sRNAi引物、sRNAi 空白质粒购于GenePharma 公司(上海，中国)。sRNAi 引物的基因序列如下：HMGB1 siRNA正义序列为5'GGGAGGAGCAUAAGAAGAATT3'，反义5'UUCUUCUUAUGCUCCUCCCTT3'。NFAT2siRNA 正义序列5'AGCGGAGGAAGAACACUAUTT3'，反义5'AUAGUGUUCUUCCUCCGCUTT3'。用于构建sRNAi质粒的2.1-U6neo 载体购于Ambion公司（德克萨斯州，美国）。

培养人单核粒细胞系THP-1细胞及人胚胎肾细胞系HEK293T细胞，细胞用含有10%的新生牛血清和双抗DMEM培养基培养。在转染前24 h用不含双抗、含10%新生牛血清的相应培养基将细胞接种在6 cm小皿中，接种时机以转染时细胞密度达到90%为准。将DNA用80 μL不含双抗和血清的培养基稀释，再用80 μL 相同的培养基稀释2.5 μL Lipofectamine2000，立即将二者混合，室温放置20 min 后，加入到含有0.8 mL 培养基和10%新生牛血清的6 cm 小皿中，4 h 后更换培养基。实验时应用100 ng/mL 脂多糖进行刺激，在不同的时间点收集细胞以及细胞培养上清。

细胞转染后24 h，取出培养皿并收集细胞，行超声破碎留取上清。上清体积约450 μL，其中从上清中吸取30 μL 留作电泳加样（input），其余约420 μL上清用于进行IP实验。每个样本中加入15 μL带琼脂糖珠子的抗体进行沉降，沉降完毕后将样品加入上样缓冲液，充分混匀，煮沸后离心，取10 μL进行Western blotting印迹分析，应用相应的抗体进行检测。

操作过程注意迅速并保持低温。刺激完毕后倒掉培养液，采用预冷的PBS液（含1 mmol/L NaF、1 mmol/L Na₃VO₄）洗涤刺激后细胞3遍，每瓶加入800 μL细胞匀浆缓冲液，用细胞刮刀迅速收集细胞。吸出后置于EP管中，冰浴摇震20 min，再加入1/10~1/5体积的75%蔗糖溶液，混匀，12 000 r/min离心10 min后去除上清。在离心沉淀物中加入30 μL的核蛋白提取缓冲液并于4 ℃冰浴摇震1 h，12 000 r/min离心30 min，取上清即为核蛋白溶液。取4 μL核蛋白上清，用去离子水稀释100倍，以紫外分光光度计测A₂₈₀值，结果乘以50，即为核蛋白提取原液中蛋白浓度，单位为μg/μL。

吸取10 μL离心上清，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后进行转膜，电转完毕后取出硝酸纤维素膜，应用特异性抗体及带荧光素酶的二抗进行结合。在暗室中，采用化学发光反应试剂盒进行检测。

所有实验重复4次，数据以均数±标准差表示，采用SPSS16.0统计软件，进行单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

应用100 ng/mL的脂多糖对THP1细胞进行刺激，在刺激后不同时间点收集细胞进行检测。结果显示，脂多糖刺激后6~24 h，细胞内的HMGB1 水平逐渐下降（图 1A，P＜0.05），同时，细胞培养上清中的HMGB1 蛋白水平却逐渐升高（图 1B，P＜0.05）。两种相反的变化趋势更证实了HMGB1可在脂多糖的刺激下由细胞内向细胞外释放。

图 1(Figure 1)

图 1 脂多糖刺激可促使THP-1细胞释放HMGB1 Figure 1 HMGB1 release from THP-1 cells in response to LPS stimulation. A: LPS stimulation decreased intracellularHMGB1 in THP-1 cells; B: LPS stimulation increased HMGB1 level in the culture supernatant. *P＜0.05,**P＜0.01.

为了探讨脂多糖刺激对NFAT2与HMGB1在胞浆内相互作用的影响，应用100 ng/mL的脂多糖对THP1细胞进行攻击。结果显示（图 2），在静息细胞内，HMGB1 与NFAT2 有较强的结合条带，而脂多糖刺激可抑制二者相互结合。随着脂多糖刺激时间的延长，免疫沉降物中所能检测到的HMGB1 条带逐渐减弱。在脂多糖刺激后24 h，HMGB1 蛋白条带已经接近消失。这提示脂多糖刺激可减弱NFAT2 与HMGB1 之间的结合，并可能因此促进了HMGB1 向细胞外的释放。

图 2(Figure 2)

图 2 脂多糖刺激可抑制NFAT2与HMGB1在细胞浆内相互结合 Figure 2 LPS stimulation depressed bindingbetween NFAT2 and HMGB1.

为了初步明确NFAT2与HMGB1在细胞核内相互作用情况，我们应用100 ng/mL的脂多糖对THP1细胞进行攻击。在脂多糖刺激的不同时间点收集细胞，提取胞核蛋白进行检测。结果显示（图 3），HMGB1 与NFAT2 没有相互结合，随着脂多糖刺激时间的延长，NFAT2蛋白在细胞核内的聚集有所增加，但没有发现二者的结合条带，这提示NFAT2 与HMGB1 之间的相互作用并不发生在细胞核内。

图 3(Figure 3)

图 3 脂多糖刺激下HMGB1与NFAT2在细胞核内相互作用情况 Figure 3 No binding between HMGB1 and NFAT2was detected in the cell nuclei.

为了探讨NFAT2 对HMGB1 释放的影响，应用NFAT2的sRNAi质粒抑制THP-1细胞中内源性NFAT2的表达。sRNAi质粒转染24 h后，收集THP-1细胞及其培养上清液，检测HMGB1 蛋白水平。结果显示，在NFAT2 受到抑制的细胞内，HMGB1 蛋白水平显著下降；而HMGB1受到抑制的细胞内，NFAT2蛋白水平没有变化（图 4A，P＞0.05）。NFAT2-sRNAi质粒可导致细胞培养上清的HMGB1蛋白浓度上升（图 4B，P＜0.05）。HMGB1及NFAT2相应的sRNAi质粒可显著抑制其基因的转录水平（图 4C，P＜0.01）。

图 4(Figure 4)

图 4 抑制NFAT2可促进HMGB1向细胞外释放 Figure 4 Inhibition of NFAT2 promoted HMGB1 release from THP-1 cells. A: Effect of NFAT2-siRNA and HMGB1-siRNAon HMGB1 and NFAT2 in THP-1 cells,respectively; B: NFAT2 inhibition increased extra-cellular HMGB1 protein level;C: Inhibition of HMGB1 and NFAT2 using siRNA plasmids. *P＜0.05,**P＜0.01,##P＜0.01.

HMGB1是一种非组蛋白DNA结合蛋白，在细胞核内可协调DNA结构解旋并启动基因转录。不仅如此，HMGB1还可由细胞核进入细胞浆，在细胞受到相应刺激后可释放到细胞外，具有广泛的生物学功能。如果能够明确HMGB1 合成释放的调控机制，则可为以HMGB1为靶点的治疗策略提供思路和线索^[14-15]。研究显示^{[12-13, 16]}，脂多糖、肿瘤坏死因子、白介素等多种因素可通过激活核因子-κB、Janus激酶-信号转导和转录激活子等通路导致HMGB1 的合成释放。已证实，HMGB1 出入细胞核主要是通过乙酰化的机制实现的。HMGB1本身具有2个非典型的核输出信号肽，在大多数细胞中，HMGB1动态的游走于细胞核及胞浆中，但核内聚集是一个主动过程，具有绝对优势，而出核则主要是被动扩散。去乙酰化时，入核增多；高度乙酰化时，出核增多^[17]。

我们的前期研究发现，HMGB1 可促进NFAT2 参与调控白介素-2 的转录表达^[18]。新近研究发现^[19-21]，NFAT2不仅是一种经典的免疫转录调节因子，还可以被炎症信号激活，参与炎症反应的调控。NFAT2可与STAT3形成蛋白复合物，在细胞核内影响染色体的转录表达。既往研究证实^[16]，STAT3可参与调控晚期炎症因子HMGB1的转录表达，并影响脓毒症大鼠的预后。因此，NFAT2极有可能参与HMGB1的信号调控，发挥其炎症调控作用。另有研究报道^[22]，NFAT2可以被炎症信号通路（如丝裂原活化蛋白激酶通路、核因子-κB通路）活化，参与调控下游的炎症反应。而且，研究发现NFAT2在细胞核内可作为架构蛋白与染色体相互作用^[23]，起到解旋并影响基因转录，这与HMGB1的细胞核内作用有类似之处，二者有可能通过相互作用，影响彼此的生物学功能。因此，本实验通过构建相应的真核表达质粒，进一步探讨NFAT2对HMGB1的调控作用。

本实验选用THP-1细胞来观察NFAT2与HMGB1之间的相互作用。单核巨噬细胞系THP-1细胞属于典型的炎症反应细胞，细胞内存在内源性NFAT2 与HMGB1 蛋白。脂多糖刺激可促进HMGB1 从THP-1细胞内向细胞外释放。随着脂多糖刺激时间的延长，细胞内的HMGB1水平逐渐下降，同时细胞培养上清中的HMGB1 蛋白水平上升。进一步实验显示，在静息THP-1细胞内，HMGB1与NFAT2相互结合。脂多糖刺激后，HMGB1与NFAT2的结合条带逐渐减弱，但是，在细胞核内没有检测到HMGB1与NFAT2的相互作用条带。这说明NFAT2在细胞浆内可能与HMGB1形成蛋白复合体，而脂多糖刺激可导致蛋白复合物解体，引起HMGB1蛋白向细胞外释放。为了从反面论证这种可能性，本实验构建了NFAT2 的sRNAi 质粒，用于抑制THP-1细胞内的NFAT2蛋白表达，观察对HMGB1释放的影响。实验结果显示，细胞内NFAT2的蛋白水平和基因转录水平受到抑制后，THP-1细胞内HMGB1蛋白水平显著下降，而细胞外培养液中的HMGB1蛋白浓度上升。这说明，随着NFAT2蛋白受到抑制，HMGB1在细胞内受到NFAT2 的影响减小，向细胞外释放增加。NFAT2的存在对HMGB1的释放有较大影响。本实验结果初步探讨了NFAT2 在细胞浆内对HMGB1 的调控作用，为进一步研究HMGB1 释放的调控机制提供了线索。