白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，严重威胁儿童健康。其中以急性淋巴细胞白血病最为常见。近年来，随着儿童白血病机制的研究和临床诊疗的发展，儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的预后显著改善，其5年无病生存率达90%。但急性T 淋巴细胞白血病（T-ALL）生存率仅为60%~75%，T-ALL发生发展的具体机制亟待研究^[1]。

Tal1，急性淋巴细胞白血病蛋白同系物1，是Ⅱ类碱性/螺旋-环-螺旋（bHLHⅡ）转录因子家族的重要成员^[2]，是造血过程中重要的转录因子，其高表达占儿童T-ALL的40%~60%^[3]。现有研究证实Tal1高表达的T-ALL恶性程度高，预后不佳，5年生存率约为40%^[3]。有文献报道，Tal1可以促进T-ALL细胞的增殖^[4-5]，而相关机制仍不清楚。本课题组通过建立Tal1 稳定转染的Jurkat细胞株，对其机制进行初步的研究，为后续的靶向治疗提供基础。

RPMI 1640 培养基和胎牛血清（Gibco）；CCK-8试剂（凯基）；anti-Tal1 抗体（Cell Signaling）和anti-GAPDH（北京中衫金桥）；anti-CDKN2A抗体（武汉三鹰）；anti-CDKN2B（Santa Cruz）；RIPA细胞裂解液（百泰克）；Trizol RNA提取液（Takara）；逆转录提取试剂盒（Takara）；Tal1过表达、Mock和siTal1慢病毒载体为吉凯公司构建；SYBR Green Ⅱ 试剂（Takara）；引物（华大基因）。

人急性T 淋巴细胞性白血病细胞Jurkat 细胞购自美国培养物集存库（ATCC）。细胞培养于含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL 和链霉素100 μg/mL 的RPMI 1640 培养液中，细胞培养于37 ℃ 5% CO₂条件中。

在细胞培养对数生长期，准备96孔细胞板，3000细胞/孔；再根据Jukat 的MOI值，加入6×10⁴ U慢病毒载体，100 μL Optimum培养基，100 μL Enhancer，和37 ℃5% CO₂孵箱6 h。换10%胎牛血清，青霉素100 U/mL 和链霉素100 μg/mL 的RPMI 1640 培养液；8 h后行镜下荧光观察GFP 荧光表达的细胞比例，细胞扩大培养后，有限稀释法对荧光细胞的筛选，然后扩大培养即得稳定细胞株以备进一步验证Tal1的表达。

取对数期细胞96 孔板铺板，细胞3000/200 μL1640完全培养基每孔，每24 h加入10 μL CCK-8试剂混匀37 ℃ 5% CO₂ 孵育3 h 后，检测450 nm 吸光度（D₄₅₀ nm），连续监测5 d。

将待检测细胞去血清培养，同步化处理后，取2~5×10⁵细胞用PBS洗2遍，弃上清，将细胞沉淀于70%乙醇混匀固定1 h，然后450 g 离心，弃上清，PBS 洗2 次，每次5 min。避光加入碘化丙啶（PI）染液，暗室混匀静置30 min，使用流式细胞仪进行检测。

每50 μL 细胞沉淀加入250 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，每间隔5 min 震荡混匀1 次。4 ℃，12 000 r/min离心30 min，保留上清。用BCA法检测蛋白浓度，加入5×Loading Buffer 混匀后85 ℃煮沸5 min，取20 μg蛋白SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（Tal1 1∶700、CDKN2A 1∶500、CDKN2B 1∶20、GAPDH 1∶20 000），4 ℃孵育过夜，次日加入二抗（1∶5000）室温孵育l h，TBST充分洗涤后，用增强化学发光系统（ECL）检测膜上信号。

（1） Trizol 法提取细胞总RNA；（2）RNA逆转录为cDNA；（3）Real-time RT-PCR：反应体系：12.5 μL SYBRⅡ，10.5 μL ddH₂0，1 μL cDNA，上下游引物（表 1）各0.5 μL。反应条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 20 s，58 ℃20 s，72 ℃ 30 s，循环35次，每个循环结束检测荧光。

表 1(Table 1)

表 1 引物信息 Table 1 Sequences of the primers for RT-PCR Primer Forward Reversed Tal1 TTCCCTATGTTCACCACCAA AAGATACGCCGCACAACTTT CDKN2A AGGTCATGATGATGGGCAGC CACCAGCGTGTCCAGGAAG CDKN2B GGGACTAGTGGAGAAGGTGC CCCATCATCATGACCTGGATCG GAPDH CAGCGACACCCACTCCTCCACCTT CATGAGGTCCACCACCCTGTTGCT

表 1 引物信息 Table 1 Sequences of the primers for RT-PCR

实验结果采用SPSS17.0统计软件进行分析，实验独立重复3次，所有数据统计显示方差齐，采用单因素分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

Real-time RT-PCR 和Western Blot 检测Tal1 在Jurkat-siTal1、Jurkat-mock1、Jurkat-T1 和Jurkat-mock2中mRNA和蛋白表达水平。结果显示Jurkat-siTal1中Tal1 的mRNA水平明显下降，而Jurkat-T1 细胞中的Tal1 mRNA水平明显升高（P＜0.05）。Western Blot 结果与Real-time RT-PCR结果一致（P＜0.05，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 Jurkat稳转细胞株的建立及Tal1的表达鉴定 Figure 1 Expression of Tal1 in Jurkat cells infected by lentivirus vectors. A,B: Real-time RT-PCR results for Tal1 mRNAexpression standardized against GAPDH; C: Western blotting for Tal1 protein expression with GAPDH as the loadingcontrol. siTal1-control served as mock1 and T1-control as mock2; D: Statistical analysis of the protein levels in differentJurkat cells. *P＜0.05,**P≤0.001.

利用CCK-8 实验连续监测5 d Jurkat-T1、Jurkatmock2、Jurkat-siTal1 和Jurkat-mock1 组的A₄₅₀值，结果显示Jurkat-siTal1 细胞中A₄₅₀值从第2~5 天显著低于Jurkat-mock1细胞，而Jurkat-T1细胞的A₄₅₀值从第2~5天显著高于Jurkat-mock2细胞（P＜0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 Tal1促进Jurkat细胞增殖 Figure 2 Statistical graph of cell proliferation in differentJurkat cells with CCK8 assay. *P＜0.05 Jurkat-siTal1 vsJurkat-mock1; **P≤0.001 Jurkat-T1 vs Jurkat-mock2.

使用流式细胞术PI染色检测不同Jurkat稳定转染细胞株的对数生长期24h时的细胞周期，结果显示细胞周期在Jurkat-siTal1与Jurkat-mock1相比时，G₀/G₁期显著增多，而S期显著减少，说明Jurkat-siTal1组G₀/G₁期向S 期的转换明显受到阻滞，而Jurkat-T1 与Jurkatmock2细胞周期相比，G₀/G₁期显著减少，而S期显著增多，说明Jurkat-T1 组G₀/G₁期向S 期的转换明显增加（P＜0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 Tal1促进Jurkat 细胞G0/G1期向S期转换 Figure 3 Tal1 promotes cell cycle transition from G0/G1 phaseto S phase in Jurkat cells. A,B: Statistical graph of cell cyclein different Jurkat cells. *P＜0.05. **P≤0.001.

通过Real-time RT-PCR检测发现，Jurkat-siTal1与Jurkat-mock1组相比，CDKN2A和CDKN2B的mRNA表达水平显著增高，而Jurkat 细胞中Tal1 过表达后CDKN2A和CDKN2B的mRNA表达水平均显著降低。通过Western blot检测发现Jurkat-siTal1组CDKN2A和CDKN2B 的蛋白表达水平显著增高，Jurkat-T1 组CDKN2A和CDKN2B的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 Jurkat细胞中Tal1抑制CDKN2A和CDKN2B表达 Figure 4 Tal1 inhibits genes expression of CDKN2A and CDKN2B in Jurkat cells. A,B: Real-time RT-PCR results for CDKN2Aand CDKN2B mRNA expression; C,D: Western blotting for CDKN2A and CDKN2B protein expression with GAPDH ascontrol. siTAL1-control served as mock1 and T1-control as mock2; E,F: Statistical graph of protein level in different Jurkatcells. *P＜0.05. **P≤0.001.

急性淋巴细胞白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，分为急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性T淋巴细胞白血病（T-ALL），T-ALL发病率比B-ALL低，仅占ALL的15%~20%，但其预后不良^[6]。目前研究发现，在65%的T-ALL病人中发生了Tal1的异常表达，且这种异常表达经常导致染色体的易位和缺失^[7]。Tal1 是П类bHLH 家族的一种转录因子，它在造血早期具有重要的作用^[8]。Tal1也是一种致癌基因，有文献报道Tal1的异常表达与T-ALL的不良预后有密切关系^[9]。在我们的研究中Tal1表达促进T-ALL Jurkat细胞增殖与进展，也说明Tal1与T-ALL的发生发展有密切的关系。

文献报道，Tal1 过表达对一些细胞周期有促进作用^[10-13]。我们检测了Jurkat稳定转染细胞的细胞周期，发现Tal1 在细胞分裂间期能够促进G₀/G₁期向S期转换。G₁期在生长因子的刺激下，CyclinD表达，并能够与CDK4、CDK6结合形成复合物，从而促进G₁期向S期的转换，而细胞内具有一组CDK 抑制因子，例如CDKN2A和CDKN2B，是CDK4特异性抑制物，能够与CyclinD竞争性结合CDK4，从而抑制细胞周期G₁向S期转换^[13-15]，在我们的研究中，利用PCR和Western blot技术检测不同Jurkat 稳定转染细胞株中CDKN2A和CDKN2B的表达，发现在Tal1 过表达的Jurkat 细胞中CDKN2A和CDKN2B表达显著降低，而在Tal1敲低组中CDKN2A和CDKN2B的表达显著升高，这些研究表明Tal1可能通过抑制CDKN2A和CDKN2B表达，来促进Jurkat 细胞的增殖，为后续的研究奠定基础。

在本研究中，Jurkat-siTal1 与mock1 细胞株相比，CDKN2A和CDKN2B mRNA和蛋白的表达升高，而Jurkat-T1与mock2细胞株相比，CDKN2A和CDKN2B的表达下降，但mRNA水平变化明显，蛋白水平变化不是很明显，这可能是由于两个原因引起的，首先，真核基因表达的转录和翻译发生的时间存在时空间隔，mRNA达到峰值时蛋白量还在增加中；其次，在转录后又会有转录后加工、转录产物的降解、翻译、翻译后加工及修饰等，因此，转录水平和翻译水平并不完全一致。有研究者对124个T-ALL病例进行分析时发现，有64%肿瘤因为发生了CDKN2A基因重排，因此在DNA水平上其表达是缺失的；在超过60%肿瘤中CDKN2A 基因在mRNA水平上也不表达^[16]，这些发现说明了CDKN2A的缺失在T-ALL中具有重要作用。当然，Tal1也可能通过不同的信号通路来影响细胞的增殖。现有文献报道，Tal1 在细胞内环境的作用下可以与不同的复合DNA亚基结合，引起白血病的发生。Tal1与急性髓细胞白血病1蛋白（RUNX1)和ETS1（P54）能够发生相互作用，这些转录因子是Tal1调节T细胞分化时所要结合一些基因时所必需的，Tal1通过抑制T细胞分化从而引起T细胞肿瘤的形成^[17]。在人类肿瘤和老鼠模型中，Tal1高表达与胸腺细胞CD4⁺CD8⁺阶段分化阻滞相关，而Jurkat细胞是CD4⁺CD8⁺T-ALL细胞，而且TAL1 异常表达，在多种T-ALL分子研究中被应用^{[2, 5]}，所以在我们的研究中应用了Jurkat 细胞作为研究对象。Jurkat 细胞属于WT型Tal1高表达的细胞株，为了更确切的说明Tal1对T-ALL细胞增殖的影响，下一步我们还需要选择一株Tal1缺失型细胞株HPB-ALL做进一步研究。

综上所述，本文发现Tal1可以通过抑制CDKN2A和CDKN2B表达来促进Jurkat细胞的增殖。但Tal1促进Jurkat细胞增殖的机制非常复杂，其他相关机制需要进一步研究。