近年来，磷脂酰胆碱（PC）作为病原菌的一种重要 致病因子受到越来越多的重视。有文献报道PC不仅有 助于流感嗜血杆菌在呼吸道中持续存在，促进其粘附并侵入支气管上皮细胞^[1-3]，PC在体内和体外还与其生物 膜的成熟有关，可以使其生物膜密度增厚^[4]。PC阳性的 流感嗜血杆菌导致渗出性中耳炎的持续性存在，愈合时 间延长^[5]。

在口腔中的研究发现，PC在伴放线放线杆菌（Aa） 的致病过程中亦起到了重要作用^[6-8]。龈沟液中PC抗体 水平明显高于血清中的水平。牙周附着丧失患者的PC 抗体水平明显高于牙周健康者。血清中的抗PC抗体可 能对携带PC 的Aa 菌株起到一定的调理素作用。Schenkein 等^[9]还发现携带PC 的Aa 菌株与不携带PC 的Aa 菌株致病力有明显差异。他们通过透射电镜观 察到带有PC 的Aa 菌株可以侵入血管内皮细胞，而不 带有PC 的菌株不能侵入血管内皮细胞，可见PC可能 是Aa的重要致病因子。

目前PC在大部分病原菌的致病过程中的机制尚不 十分清楚，有文献报道，PC可能是通过细菌细胞壁的胆 碱成分通过与内皮细胞表面的血小板活化因子受体 （PAFR）结合来介导的^[10-11]。血小板活化因子（PAF）中 含有磷脂酰胆碱成分，当细菌与宿主细胞作用时，细菌 中的磷脂酰胆碱通过模拟PAF，与PAFR结合，从而介导 细菌对宿主细胞的黏附和侵袭。然而关于PC如何在 Aa致病过程中起作用，PAFR是否参与了PC阳性Aa黏 附、侵袭宿主细胞的过程的鲜有文献报道，在本实验中 我们拟选用人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC），建立体 外模型，研究PAFR 在PC 阳性Aa 菌株对HUVEC的 黏附和侵袭过程中的作用。

PC 阳性Aa 菌株(HK1651：美国ATCC)；PC 阴性 Aa菌株（ATCC29523：广东省微生物菌种保藏中心）。 人脐静脉血管内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelia Cell,HUVEC）：购自中科院上海细胞所细 胞库。

DMEM 培养基、胎牛血清、0.25% EDTA/胰酶均购 自Hyclone；二甲基亚砜（DMSO）购自北京鼎国昌盛生 物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）、血小板活化因子受体 拮抗剂（CV-3988）购自Sigma；血小板活化因子受体抗 （anti-PAFR）购自药明康德新药开发有限公司。

将冻存的HUVEC复苏后至少传代 2次，将细胞以1×10⁵/孔的浓度接种于24 孔细胞培养板 中，5% CO₂，37 ℃孵育24 h，待长满细胞单层。实验前 用DMEM 培养基清洗3 次，分别加入含CV-3988（终浓 度分别为50、100、200、500 nmol/L）、PAFR 单克隆抗体 （终浓度为2.5 μg/mL）及TEPC-15（终浓度为2.5 μg/mL） 的完全培养基，作用30 min。

将PC 阳性和阴性菌株复苏后分别 倍比稀释接种到AAGM 平板上，5% CO₂，37 ℃厌氧培 养3~5 d。先在平板上挑取细菌单克隆，以100∶1 接种 到脑心浸液培养基中，摇床37 ℃，250 r/min，摇12 h。 第2 天再把摇好的菌液取1~2 mL的脑心浸液培养基 中，同样条件继续摇12 h。实验前将菌液浓度调整到1× 10⁹ cfu/Ml，备用。

将细菌按照100∶1（MOI=100）的比例加入到每孔 细胞中去，37 ℃，5 % CO₂孵育4 h，去掉培养基，1×PBS 清洗3 次，加入150 μL 0.5%Triton-X100，37 ℃孵育 15 min，然后加入350 μL去离子水，37 ℃孵育10 min，轻柔吹打混匀，取100 μL样品倍比稀释涂布AAGM平 板计算菌落数，作为黏附到细胞的细菌数。

将细菌按照100∶1 的比例加到每孔细胞，37 ℃，5% CO₂孵育4 h，用1×PBS 清洗3 次，每孔加入1 mL 完全培养基，再加入终浓度为200 μg/mL的庆大霉素 37 ℃孵育2 h，杀死细胞外细菌，1×PBS清洗3次，加入 150 μL 0.5%Triton-X100，37 ℃孵育15 min，然后加入 350 μL去离子水，37 ℃孵育10 min，轻柔吹打混匀，取 100 μL样品倍比稀释涂AAGM平板计算菌落数，作为 侵袭到细胞内的细菌数。

黏附实验和侵袭实验3组菌各设3个复孔，重复实 验3次。设置对照组：不加处理剂组。

黏附率= 处理组黏附到细胞的细菌数/未处理组黏 附到细胞的细菌总数×100%

侵袭率= 处理组侵入细胞内的细菌数/未处理组侵 入细胞内的细菌总数×100%

实验前1 d，将培养瓶里的细胞用 0.25%胰酶消化后计数，调整细胞悬液浓度，以1×10⁵ 个 细胞/孔的浓度接种于96孔板，5% CO₂，37 ℃孵育。待 细胞贴壁后，分别加入CV-3988（终浓度分别为10、20、 50、100、200 nmol/L）及PAFR 单克隆抗体（终浓度为 2.5 μg/mL），作用30 min。

细菌的处理方法及步骤如上所述，调整细菌浓度为1×10⁸ cfu/mL，取稀释好的菌液1 mL，8000 r/min离心5 min，弃掉上清，加入1 mL PBS重悬，离心3 次，取1 mL DMEM 培养基重悬，取100 μL （MOI=100）加入各孔中。5% CO₂，37 ℃继续孵育12 h。 每孔加入MTT（5 g/L）20 μL,继续培养4 h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇 床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。置于酶联 免疫检测仪，选择490 nmol/L 处波长，空白孔调零，测 定各孔吸光度值（A），各组A值取平均值后，以下公 式计算存活细胞百分数，存活细胞%=A实验组/A 对 照组×100%。

每组同时设置调零孔（DMEM培养基）及对照组 （未加细菌菌液组），每组设定3个复孔，重复实验3次。

数据均表示为均数±标准差，与常数组之间的比较 采用单样本t检验，用Bonferroni法校正检验水准；多组间比较采用单因素方差分析，不同处理组之间的两两比 较，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T₃ 法。相关性分析采用Spearman 法。P＜0.05 认为差异 有统计学意义。数据分析采用SPSS 13.0软件。

为了研究PAFR是否参与了Aa对HUVEC的黏附 和侵袭过程，我们将HUVEC用PAFR拮抗剂（CV3988） 和抗PAFR抗体预处理30 min后，研究PC阳性Aa的黏 附率和侵袭率。经过对数据的统计分析我们发现，当 PAFR拮抗剂的浓度达到100 nmol/L时即可以显著的 减少Aa 对HUVEC 的黏附（36.29 ± 3.52）%和侵袭 （12.12±1.58）%（P＜0.05）。同时根据相关性分析，黏附 率和侵袭率与CV3988的浓度均呈显著负相关（黏附率 r=-0.972，P=0.000；侵袭率r=-0.972，P=0.000），随着 PAFR拮抗剂浓度的升高，Aa对细胞的黏附率和侵袭率 逐渐下降，200 nmol/L时的黏附率和侵袭率分别降低为 对照组的（19.04±3.35）%和（7.08±0.29）%。当PAFR拮 抗剂的浓度为500 nmol/L 时，Aa 几乎不能够对 HUVEC进行黏附（7.69±3.19）%和侵袭（2.60±2.26）%，如图 1和图 2所示。

图 1(Figure 1)

图 1 PC阳性Aa的相对黏附率 Figure 1 Relative adhesion of PC-positive Aa in cultured HUVECs (%,Mean±SD). The adhesion of Aa differed significantly between pretreated and unpretreated cells (*P＜0.05)

图 2(Figure 2)

图 2 PC阳性Aa的相对侵袭率 Figure 2 Relative invasion of PC-positive Aa in cultured HUVECs (%,Mean±SD). The invasion rates differed significantly between pretreated and unpretreated cells (*P＜0.05) 中文注解 英文注解

同样，用抗PAFR抗体预处理HUVEC后，与对照 组相比，Aa对HUVEC的黏附率和侵袭率均有显著的降 低，分别为（50.05±5.28）%和（39.09±6.50）%，明显的阻 止了Aa对宿主细胞的黏附和侵入（图 2）。

为了研究PAFR是否参与了PC 阳性的Aa诱导的 细胞损伤的过程，我们将PAFR拮抗剂（CV3988）和抗 PAFR抗体作用于细胞后，采用MTT法分别分析了PC 阳性和阴性的Aa诱导的细胞损伤情况。

我们首先对HUVEC在不同的处理剂中的存活率 进行了分析，将结果进行统计学分析，发现HUVEC在 各种浓度的处理剂中的存活率无明显差异（P＞0.05），如 表 1所示。从而排除了因处理剂对细胞的影响而引起 的各组间细胞存活率的差异。

表 1(Table 1)

表 1 无菌组细胞存活率（%）的比较 Table 1 Cell viability of HUVECs (%) treated with different concentrations of CV3988 (n=3,Mean±SD) CV3988 (nmol/L) #F P 0 50 100 200 500 Cell viability 100 98.53±0.69 95.82±1.44 96.55±1.39 97.17±1.02 0.967 0.467 #P - 0.260 0.152 0.200 0.164 - - The #P value is equal to the P value of P=4 after the correction. #F compared with each treatment group without treatment group.

表 1 无菌组细胞存活率（%）的比较 Table 1 Cell viability of HUVECs (%) treated with different concentrations of CV3988 (n=3,Mean±SD)

在PC 阳性的Aa 组，我们发现，各组间细胞存活 率有显著差异（F=87.749，P＜0.001），用200 nmol/L 和 500 nmol/L 的PAFR拮抗剂和25 μg/mL抗PAFR抗体 预处理HUVEC后，细胞的存活率显著升高，从（25.39± 9.33）%分别升高到（91.12±3.14）%，（94.12±2.15）%和 （65.5±1.87）%（图 3）。对数据进行相关分析，细胞的存 活率与PAFR 拮抗剂之间存在显著正相关关系（r=0.938，P=0.000）由此可见，PAFR拮抗剂和抗PAFR抗 体有效的阻止了PC阳性的Aa诱导的细胞死亡。

图 3(Figure 3)

图 3 PC阳性组细胞存活率 Figure 3 Cell viability of pretreated HUVECs after incubation with PC-positive Aa by MTT assay (Mean± SD). *P＜0.05 vs CTL.

我们同时对PC 阴性的Aa 进行了研究及分析证 实了这一结果（图 4）。通过对预处理和未预处理组 进行相比，各组之间无统计学差异（F=0.437，P= 0.799），说明PC阴性的Aa感染HUVEC后，细胞存活 率并没有显著增加。对数据进行相关分析显示，细 胞存活率与PAFR拮抗剂之间无相关性（r=0.350，P= 0.200）。

图 4(Figure 4)

图 4 PC阴性组细胞存活率 Figure 4 Cell viability of pretreated HUVECs following incubation with PC-negative Aa by MTT assay (Mean ± SD). *P＞0.05

对宿主细胞的黏附和侵袭是各种病原菌发挥致病 作用的关键环节。目前认为Aa 侵入宿主细胞的过程是一个动态的、多步骤的、复杂的过程，Aa 在进入宿主细 胞的过程受到细胞表面受体的介导及调控^[19-20]。

PAFR 属于G 蛋白偶联受体家族，通过与血小板活 化因子(PAF)结合介导细胞的内吞作用。Barbier 等^[21] 报道PC 与PAFR 结合后可介导铜绿假单胞菌定植在 呼吸道上皮细胞。Schenkein等^[9]曾经提出PC 阳性的 Aa 菌株对HUVEC 的黏附和侵袭可能也是通过PAFR 介导的。为此，我们在本实验中对PAFR是否介导了PC 阳性Aa的黏附侵袭过程进行了研究。我们在培养基中 加入PAFR 拮抗剂CV-3988，然后观察到当PAFR受到 抑制后Aa 对细胞的黏附和侵袭发生了明显下降，当 CV-3988 的浓度升高到一定程度时，几乎完全阻止了 Aa 对HUVEC的黏附和侵袭。为了进一步验证PAFR 参与了Aa 对HUVEC的黏附和侵袭，我们利用PAFR 抗体对PAFR进行了抑制，同样发现PAFR受到抑制后，Aa 的黏附、侵袭及细胞活力均受到了明显影响。这与 Smani等^[22]的研究相似，PAFR介导了鲍氏不动杆菌对 人肺上皮细胞的黏附和侵袭的过程。

Smani 等^[22-23]在实验中发现鲍氏不动杆菌表面的 PC与人肺上皮细胞表面的PAFR结合，引起一系列下游 信号通路的激活，完成细菌的内吞或跨膜过程，最终导 致了宿主细胞的死亡。我们在实验中检测了PAFR受 到抑制后Aa对细胞活力的影响，同样发现未处理组细 胞活力明显降低，可见PAFR受到抑制后，明显降低了 Aa对细胞的毒力作用。因此我们推测，当Aa 接触到 HUVEC 后，其表面的PC可能与细胞表面的PAFR结 合，从而传递信号给细胞膜，诱发一系列下游信号系统 的级联反应，使得Aa 对宿主细胞进行侵袭和杀伤，最终 导致了宿主细胞的死亡。

综上所述，本研究发现PAFR介导了Aa黏附和侵 袭HUVEC的过程。由于PAFR存在于多种内皮细胞和 上皮细胞表面，包括牙周黏膜上皮细胞等，因此，PAFR 可能同样介导了Aa对牙周组织的入侵过程，这为我们 研究Aa 在牙周病中的致病机制提供了新的思路。