烧伤，尤其是大面积烧伤将引起机体发生一系列的免疫学及病理生理学变化，造成机体免疫功能紊乱^[1]。目前对于烧伤免疫方面的研究多是对免疫细胞、免疫因子的作用机制或感染、器官损伤等方面的研究^[2]，这些研究或多或少的揭示了部分烧伤后免疫功能紊乱的发生机制，但在后基因组时代，从单一的基因及因子的研究出发时很难解释整个细胞或系统的变化。2010 年Evers等^[3]就已经提出基因芯片从细胞整体基因组水平出发，能为烧伤后免疫紊乱机制的研究提供新的思路及治疗靶点。

本课题组在前期通过对GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中一组小鼠烧伤后白细胞基因芯片的数据进行分析发现烧伤后小鼠白细胞表现为免疫系统过程、细胞过程、代谢过程、应对刺激反应等方面的紊乱，并针对免疫系统变化过程深入分析发现Lck、Ccr2、Tlr2及Myd88等基因在烧伤后免疫系统功能变化过程中起到重要作用^[4]。而对于烧伤后免疫细胞应对烧伤刺激反应过程的变化机制尚未研究。为此本实验应用小鼠烧伤后免疫细胞基因芯片数据来了解烧伤后应对刺激反应的基因表达变化及其生物学特性，旨在阐述烧伤后免疫细胞应对刺激变化过程的分子机制，为临床上烧伤早期诊断及治疗靶点的筛选提供新方向。

健康成年的雄性BALB/C小鼠180只，体质量20~22 g，由南方医科大学实验中心提供（许可证编号：SCXK粤2011-0015），清洁级饲养。本研究所使用小鼠外周血白细胞分离液试剂盒（细胞培养及分子生物学专用）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，柱式法Total RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）、反转录试剂盒（PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNAEraser，Takara）、SYBR法Q-PCR 试剂盒（SYBR Premix Ex Taq^TM，Takara）购自广州瑞真生物技术有限公司。本研究所使用仪器主要有GeneAmp PCR System 9700扩增仪及罗氏480荧光定量PCR仪。

本研究所用的GSE7404^[5]（小鼠，25%TBSA, 全层烧伤）数据集来源于NCBI 的GEO 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），是GPL1261 平台Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array基因芯片，为全血游离白细胞基因芯片数据。我们从中选取烧伤后1 d组样本进行分析，共有8个样本，其中4个为烧伤组，4个为对照组。原始数据进行RMA（robust multiarray average）背景矫正，四分位数法进行归一化处理，并对数据进行汇总以获取表达水平数据^[6-7]。最后采用配对样本t检验和倍比法^[8]（FC）获取差异表达基因，差异基因需同时满足以下条件：①p-value≤0.01；②|logFC|>1。

将差异基因输入到DAVID^[9]（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）网络数据库进行Gene Ontology（GO）^[10]分析，应用EASE（Expression Analysis Systemic Explorer）方法选取EASE＜0.1 注释基因条目。并选取刺激反应相关差异基因并进行KEGG通路富集分析，选取与烧伤后免疫细胞刺激反应相关通路。

将选取的免疫系统相关差异基因应用DAVID进行基因ID转换，将转换的差异基因输入到STRING9.1^[11]数据库中，选取交互作用评分大于0.4（中等可信度）的互作关系构建刺激反应相关差异基因的蛋白互作网络（Protein-protein interaction network）。网络分析及MCL 子网络聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件^[12]进行。

假烫伤组（Sham）36 只，25% Ⅲ°烫伤组^[13]144 只。随机选取烫伤组烫伤后2、6、12、24 h及假烫伤组分别12只小鼠，腹腔麻醉后，开胸心尖取血，血液行肝素抗凝处理后，立即行白细胞提取。

小鼠白细胞总RNA的提取按照柱式法Total RNA 提取试剂盒使用说明书进行操作，并用琼脂糖凝胶电泳判断RNA有无降解，以及用微量核酸定量仪检测所提取RNA的浓度和纯度，RNA的A_260/280吸光值比率在1.8~2.1范围内者方可进行后续实验。

反转录合成cDNA反应使用反转录试剂盒在PCR 扩增仪上操作，cDNA合成后避光保存于-20 ℃冰箱。荧光定量PCR反应使用SYBR法Q-PCR试剂盒在罗氏480荧光定量PCR仪上操作。Lck、Stat1、Myd88、Stat3、Jun基因和MM-GAPDH内参基因的引物序列（上海英潍捷基贸易公司合成）见表 1。最后采用2^-△△Ct方法^[14]计算基因相对表达值。

表 1(Table 1)

表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR Target Gene Primer sequences(5'→3') Stat-1 Forward primer: TACGGAAAAGCAAGCGTAATCT Reverse primer: TGCACATGACTTGATCCTTCAC Lck Forward primer: TGGAGAACATTGACGTGTGTG Reverse primer: ATCCCTCATAGGTGACCAGTG Myd88 Forward primer: GGAGTCCGAGAAGCCTTTACAG Reverse primer: GGTCGGACACACACAACTTAAG Stat-3 Forward primer: ACCTCCAGGACGACTTTGAT Reverse primer: TGTCTTCTGCACGTACTCCA Jun Forward primer: CTTCTACGACGATGCCCTCAA Reverse primer: GGAAGCGTGTTCTGGCTATGC MM-GAPDH Forward primer：AGGATGTGAAGGATGGGAAG Reverse primer：TTCTTCAGCCTCTCCAGGTC

表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR

本实验采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，P＜0.05为有统计学意义。

在烧伤后第1天差异基因进行基因本体分析（GO 分析）显示，共有259个刺激反应相关差异基因被选出，其中上调基因118个，下调基因141个。通过KEGG通路富集结果显示前10个通路符合阈值要求并被显著富集（表 2）。主要为免疫系统相关通路（toll样受体信号通路；B细胞受体信号通路；T细胞受体信号通路等）；细胞过程中的细胞生长与死亡相关通路（p53信号通路；细胞凋亡通路）；环境信息进程中的信号转导相关通路。其中差异基因富集最多、最显著的为toll 样受体信号通路，在烧伤后第1天中，差异基因在通路中的富集情况（图 2）。

表 2(Table 2)

表 2 差异表达基因富集KEGG通路结果 Table 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis for the interacting genes Term Pathway Count % P Class mmu04620 Toll-like receptor signaling pathway 18 6.94 1.30E-10 Immune system mmu04115 p53 signaling pathway 12 4.63 6.22E-07 Cell growth and death mmu04612 Antigen processing and presentation 13 5.01 1.56E-06 Immune system mmu04662 B cell receptor signaling pathway 12 4.63 2.85E-06 Immune system mmu04660 T cell receptor signaling pathway 14 5.41 4.45E-06 Immune system mmu04210 Apoptosis 11 4.24 4.10E-05 Cell growth and death mmu04060 Cytokine-cytokine receptor interaction 18 6.94 7.25E-05 Signaling molecules and interaction mmu04062 Chemokine signaling pathway 15 5.79 1.15E-04 Immune system mmu05340 Primary immunodeficiency 7 2.71 1.94E-04 Immune diseases mmu05320 Autoimmune thyroid disease 9 3.47 3.14E-04 Immune diseases

表 2 差异表达基因富集KEGG通路结果 Table 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis for the interacting genes

图 1(Figure 1)

图 1 差异基因在Toll样受体信号通路中的富集情况。红色代表刺激反应上调基因，蓝色代表刺激反应下调基因 Figure 1 KEGG pathway map of the Toll-like receptor signaling pathway. The grid with the rounded edge represents another pathway.Blue-marked nodes are associated with downregulated genes and red-marked nodes with upregulated genes. The green nodes have no specific significance.

图 2(Figure 2)

图 2 刺激反应相关蛋白互作网络 Figure 2 Interaction network of the genes involved in the stimulus response. Red dots represent genes upregulatd and blue dots represent genes downregulated. The edges represent interaction.

刺激反应相关蛋白互作网络共有226个节点，1232条边组成（图 2）。其中前10个具有最高互作关系的基因，如表 3所示。MCL分析总共有7个子网络被选出，如图 3所示。通过蛋白互作网络分析显示：Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun 5个基因同时具有最大互作关系和在子网络中处于中心位置。

表 3(Table 3)

表 3 免疫基因互作网络中互作关系最高的前10个差异基因 Table 3 Top 10 interacting genes in the PPI network Gene Degree Regulation Official Full Name Jun 67 Up Jun oncogene Stat1 67 Down signal transducer and activator of transcription 1 Bcl2 56 Down B cell leukemia/lymphoma 2 Stat3 54 Up signal transducer and activator of transcription 3 Tlr2 47 Up toll-like receptor 2 Myd88 45 Up myeloid differentiation primary response gene 88 Jak2 41 Up Janus kinase 2 Lck 40 Down lymphocyte protein tyrosine kinase Hck 38 Down hemopoietic cell kinase Ptpn6 38 Down protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 6

表 3 免疫基因互作网络中互作关系最高的前10个差异基因 Table 3 Top 10 interacting genes in the PPI network

图 3(Figure 3)

图 3 MCL网络分析子网络图 Figure 3 Clusters A-J and the subnetworks in PPI network. Red nodes represent genes upregulatd and blue nodes represent genes downregulated.

通过RT-PCR技术检测小鼠烧伤后白细胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3 和Jun mRNA的表达情况（图 4）。Lck基因表达量在烧伤后12 h处于较低水平，在24 h内较sham组整体表达下降（图 4A）。Stat1基因表达量在24 h内表现出逐渐下降趋势（图 4B）。而Myd88、Stat3和Jnu 基因表达量在烧伤后24 h 内皆较sham 明显增加。因此实时荧光定量PCR技术检测显示Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因表达情况与芯片数据分析结果相一致。

图 4(Figure 4)

图 4 Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun 基因在烧伤后24 h表达水平 Figure 4 Lck, Stat1, Myd88, Stat3 and Jun mRNA expression changes in mice at 24 h post-burn.*P＜0.01, **P＜0.05 vs sham group.

基因芯片技术自发明至今已被应用到生物科学众多的领域之中。基因芯片技术和生物信息学分析方法为从转录水平或DNA层面全面了解烧伤后复杂的病理生理学变化过程提供了可能。在本研究中，在烧伤后第1天差异基因进行基因本体分析（GO分析）显示，共有259 个刺激反应相关差异基因被选出，其中上调基因118个，下调基因141个。KEGG通路富集结果显示刺激反应相关差异基因主要与免疫系统、细胞生长与死亡及信号转导等通路相关。通过蛋白互作网络分析显示：Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因同时具有最大互作关系和在子网络中处于中心位置。我们通过动物实验也证明了Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因表达情况与数据分析结果相一致。

Lck基因编码所产生p56（Lck），是非受体酪氨酸蛋白激酶致癌基因家族成员之一。Lck激酶相对特异地存在于淋巴细胞中，特别是成熟静止的T淋巴细胞，在T 细胞活化信号转导及分化调节中起到重要作用^[15]。P56（Lck）蛋白锚定到细胞膜并与CD4/CD8共同受体的胞内结构域相互作用，并具有酪氨酸激酶活性^[16-17]。Lck 激酶参与了IL-2信号转导途径，调节T细胞的增殖。在胸腺细胞中，Lck激酶磷酸化ZAP-70激酶，促进下游信号转导分子的募集，以致影响细胞的增殖和分化^[18]。研究表明，选择性抑制Lck激酶可以为T细胞介导的自身免疫性疾病、炎症性疾病及器官移植排斥反应提供治疗^[19]。而有文献报道，烧伤后适应性免疫应答的变化主要有T 淋巴细胞的增殖能力和其分泌IL-2免疫刺激性因子的功能长时间受抑制，并伴随有T 淋巴细胞总数以及CD4/CD8比值降低^[20]。本研究结果表明Lck基因在烫伤后24 h表达量持续减少，与其功能相结合正支持上述理论，也揭示了Lck在烧伤后刺激反应所致免疫应答中发挥了重要作用。

信号传导与转录激活因子（STAT）蛋白家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性^[21]。有关研究发现STAT蛋白家族中，STAT1 和STAT3 在免疫反应过程中发挥重要功能。STAT1活化促进INF-α/β/γ的表达，上调MHC-I和II类分子、共刺激分子和趋化分子表达，促进DC成熟分化^[22-23]。并激活巨噬细胞、NK细胞、肿瘤特异性CTL反应杀伤肿瘤细胞^[24]。促进向Thl型细胞分化和促进促炎症性细胞因子产生^[25]。然而，STAT3在免疫反应中所起的作用与STAT1恰恰相反^[26]。作为免疫系统负调节蛋白的STAT3，诱导免疫抑制因子TGF-β、IL-10 等的表达，通过下调MHC-I 类分子、MHC-II 类分子、CD80、CD86 和IL-12 的水平，抑制噬中性粒细胞、NK细胞、DC细胞的活性，从而抑制免疫系统的活性^[27]。本实验结果示在烧伤后24 h STAT1基因表达量持续减少，而STAT3基因表达量增加，这反应了在烧伤早期机体已出现免疫功能抑制，从而导致临床上烧伤早期患者免疫功能低下易感染及死亡。

Myd88（髓样分化因子88）分子发现于髓样细胞的分化中，作为衔接蛋白在机体固有免疫应答反应中能直接参与到Toll样受体信号转导通路中。Toll样受体不仅是固有免疫系统识别病原相关分子模式的主要受体，而且其启动的信号通路还能调控适应性免疫应答^[28]。Myd88通过启动IRAK-1、IRAK-4和TRAF6等作用快速激活MAPK和NF-κB传导途径来调控IL-1、IL-6 和TNF-α等炎症因子的转录^[29-31]。因此，Myd88作为重要的转导蛋白，不仅在信号途径中发挥着关键作用，还通过调控细胞因子的分泌影响适应性免疫应答。本研究显示烧伤后24h Myd88表达量的升高，这也说明烧伤早期Myd88通过多种机制参与应对刺激反应的免疫应答过程，从而维持内环境的稳定。因此若能研究出新药在分子水平调控Myd88，相信在烧伤早期对病人的治疗上会有新的方法。

Jun基因是转录因子AP-1家族成员之一，Fos蛋白与Jun蛋白在细胞核内通过亮氨酸拉链结构形成异源二聚体复合物-转录因子AP-1，以高亲和力在靶基因的AP-1位点，进一步激活靶基因的表达而最终对刺激做出反应^[32]。Jun在绝大多数细胞中呈极低水平表达，参与细胞生长、繁殖、分化等生理过程^[33]。而病理条件下，Jun的过度表达及调控变化可能与多种疾病及机体损伤有关^[34]。有相关研究发现，Jun在中枢神经系统的表达与伤害性感觉或痛觉有关，Jun可作为中枢神经系统对伤害性刺激反应的标志^[35]。因此，本实验结果显示烧伤早期Jun基因表达上调可能与烧伤刺激有关。

综上所述，小鼠烧伤后第1天全血游离白细胞Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun基因在烧伤早期刺激反应过程中发挥着重要的作用。本研究所筛选出来差异表达基因从分子水平为我们探讨烧伤早期刺激反应机制提供理论依据，为临床上烧伤早期诊断及治疗靶点的筛选提供了新方向。我们会对烧伤后期刺激反应进行进一步研究，探索机体从烧伤至完全恢复全过程差异表达基因的表达情况，为更全面探索烧伤刺激反应机制及临床烧伤诊治提供新的方向。