2015, Vol. 35
2. 肿瘤研究所，广东 广州 510515
2. Cancer Research Institute, SouthernMedical University, Guangzhou 510515, China
上皮性卵巢癌（EOC）是女性生殖器常见的3大恶性肿瘤之一，患者5年生存率不足30%，已成为严重威胁全世界妇女生命和健康的主要肿瘤[1]。临床上因卵巢癌起病隐匿，缺乏典型的早期症状，约有70%的患者一经诊断已属晚期，并且研究表明约有70%的患者两年内会出现复发和转移[2-3]，很难进行根治性手术。因此，EOC被认为是预后较差的妇科恶性肿瘤之一。上皮间质转化（EMT）的异常激活是肿瘤发生发展的重要因素，其特征是上皮细胞失去极性和接触抑制而获得间质表型，且细胞的侵袭和迁移能力增强[4-5]。研究发现，E盒锌指结合蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2, ZEB2）通过与E-cadherin基因启动子的E盒结合，抑制E-cadherin的表达，诱导细胞发生上皮-间质转化，从而增强细胞的转移和侵袭能力[6]。ZEB2 在许多恶性肿瘤组织中能够增强肿瘤细胞的侵袭、转移，如大肠癌[7]、胃癌[8]、乳癌[9]等，但目前ZEB2在EOC组织中的表达情况鲜有报道。原癌基因C-myc（cellular avian myelocytoma virus, C-myc）与细胞生长调控、肿瘤发生及细胞凋亡密切相关[10-11]，其过度表达极有可能促进肿瘤的恶变、进展等过程。目前，关于ZEB2与C-myc蛋白表达与EOC临床病理特征等相关性研究，国内外尚未见文献报道。本研究通过对191 例EOC 组织中ZEB2 与C-myc 表达水平进行检测，分析ZEB2 与C-myc之间的关系，并探讨它们与EOC侵袭、转移以及临床病理特征之间的关系。
1 材料和方法 1.1 临床资料选取2008 年9 月~2015 年1 月南方医科大学第三附属医院病理科存档石蜡包埋卵巢组织标本204例，其中正常卵巢组织13 例、EOC组织191 例（浆液性腺癌159 例，粘液性腺癌32 例），均经病理学证实。191 例EOC患者年龄在22~81岁之间，其中≥47 岁182例，＜47岁9例；根据国际FIGO临床分期标准：Ⅰ期137例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期17 例，Ⅳ期9 例。EOC T分期中T1 期139例，T2期32例，T3期20例；无淋巴结转移173例，有淋巴结转移18 例；无远处转移182 例，有远处转移9 例。所有患者术前均未行放疗、化疗、生物治疗。对照组为同期因非卵巢疾病接受手术治疗获得的正常卵巢标本，共13例正常卵巢组织。
1.2 主要试剂小鼠抗人ZEB2单克隆抗体和小鼠抗人C-myc单克隆抗体均购自美国Abcam公司；SP试剂盒及DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。
1.3 免疫组织化学检测及结果判定将蜡块制成4 μm厚切片，免疫组化操作步骤严格按试剂盒说明书进行，一抗均按1:100稀释。以ZEB2与C-myc的阳性切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。结果判定采用双盲法，同时由2位资深病理科医师独立观察每张切片后进行判定。判定标准采用半定量评分法，根据染色强度和阳性细胞百分比进行判定[12]。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，1%~为1分，10%~为2分，50%~为3 分，75%~为4 分。2 项评分乘积≤4为阴性，>4分为阳性。
1.4 统计学处理实验数据采用SPSS 20.0 软件进行实验数据分析。ZEB2和C-myc在EOC组织及正常卵巢组织的表达、各临床病理因素之间的相关性及相关关系均采用χ2和Spearman等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ZEB2在EOC组织中的表达及其与临床病理因素ZEB2蛋白主要分布于肿瘤细胞的胞质，也可出现细胞核的表达，呈淡黄色至棕褐色颗粒，在正常组织及卵巢癌组织阳性表达率分别为30.8%（4/13）和49.2%（94/191），差异有统计学意义（P=0.007）。ZEB2表达与EOC的病理分型相关，在粘液性腺癌组比浆液性腺癌组中有更高的阳性表达率（75% vs 44%，P=0.003）；且表达与FIGO分期、T分期、淋巴结转移有关，在Ⅲ~Ⅳ期中比Ⅰ~Ⅱ期中有更高的阳性表达率（69.2% vs 46.1%，P=0.028）；在肿瘤T分期中阳性表达率T3>T2>T1（80% vs 62.5% vs 41.7%，P=0.002）；有淋巴结转移者阳性表达率高于无淋巴结转移者（46.8% vs 13.8%，P=0.04）；但与年龄、分化程度、远处转移等不相关（表 1、2、图 1A、B）。
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表 1 191例EOC组织中ZEB2及C-myc的表达与临床病理因素的关系 Table 1 Correlation of ZEB2 and C-myc with clinicopathologic indexes in 191 patients with EOC |
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表 2 EOC和正常卵巢组织中ZEB2及C-myc的表达 Table 2 ZEB2 and C-myc protein expression in the ovarian and EOC tissues |
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图 1 ZEB2蛋白在EOC组织的细胞质中表达及C-myc蛋白在EOC组织的细胞核中表达 Figure 1 ZEB2 (A, B) and C-myc (C, D) protein expressions in cellular cytoplasm of EOC tissues (Original magnification: ×400) . A, C: High expressions; B, D: Low expression. |
C-myc蛋白主要定位于细胞核，也可出现细胞质的表达，呈棕褐色颗粒，在正常组织及EOC组织表达率分别为15.4%（2/13）和53.9%（103/191），差异具有统计学意义（P=0.001）。C-myc基因的表达与EOC的分化程度相关，在低分化组比高分化癌组中有更高的阳性表达率（59.7% vs 43.3%，P=0.039）；且表达与EOC的FIGO 分期、T相关，在Ⅲ~Ⅳ期中比Ⅰ~Ⅱ期有更高的阳性表达率（73.1% vs 51.0%，P=0.035）；在T分期的阳性表达率T3>T2>T1（80% vs 62.5% vs 48.2%，P=0.002）；但与年龄、病理分型、淋巴结转移、远处转移等不相关。（表 1、2、图 1C、D）。
2.3 ZEB2及C-myc的表达在EOC组织中的相互关系ZEB2和C-myc在EOC中的表达经过Spearman相关性分析，两者呈正相关性（相关系数R=0.358，P＜0.001）。同时ZEB2 及C-myc 的共同表达与T分期和FIGO分期有关（P＜0.001，P＜0.008，表 3、4）。
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表 3 EOC组织中ZEB2及C-myc的表达之间的相互关系 Table 3 Correlation between the expression of C-myc and ZEB2 in EOC |
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表 4 EOC中ZEB2及C-myc的共同表达之间的相互关系 Table 4 Co-expression of the two proteins in EOC |
ZEB2是ZEB转录因子家族的一员，ZEB2与ZEB 家族的另一个成员ZEB1高度同源。ZEB2和ZEB1都参与脊椎动物的胚胎发育，并通过调控EMT过程而参与恶性肿瘤的发生和发展[13]。ZEB2能与E-cadherin编码基因的启动子上的E2盒的[CACCT（G）]结合，抑制E-cadherin的转录，诱导细胞发生EMT，增强细胞的侵袭转移能力[13]。已有研究证实其可促进膀胱癌、乳腺癌及鼻咽癌细胞的转移能力，且有研究表明其表达上调可独立预测头颈部癌的不良预后[14-17]。但目前其在EOC 中的研究还十分有限，且机制并不很清楚。本研究结果显示：ZEB2蛋白主要定位于细胞质，EOC组织阳性表达率为49.2%高于正常卵巢组织30.8%，差异具有统计学意义，这与Cai[18]报道ZEB2在肝癌组织中的阳性表达率相一致。而且随着肿瘤T分级的升高，ZEB2的阳性表达率也随之增高；EOC组织中有淋巴结转移者的ZEB2阳性表达率远高于无淋巴转移者，表明ZEB2表达对EOC的淋巴结转移起着促进的作用，这与以往研究结果一致[8]。ZEB2在FIGO分期中Ⅲ~Ⅳ期阳性表达率为69.2%，在Ⅰ~Ⅱ期中为46.1%，差异有统计学意义，与Huang等[19]观点一致。综合这些结果说明，ZEB2作为转录因子，其高表达与EOC转移、肿瘤TNM分期确切有关，ZEB2表达越高TNM分期越高，淋巴结转移的可能性也越高。ZEB2作为促基因在肿瘤转移中发挥作用，它可能成为评价EOC发展、转移的一个有价值的指标。
原癌基因C-myc为序列特异性转录因子，该基因定位于染色体8q34，编码磷酸化蛋白。C-myc编码蛋白具有促进DNA复制，调节细胞周期、细胞增殖及分化等功能[20]。其表达与细胞生长调控、肿瘤发生及细胞凋亡有密切关系[10-11]。C-myc过度表达能够诱导细胞由静止期进入分裂周期，促进细胞的增殖从而导致肿瘤的发生[21-22]。在乳腺癌中C-myc癌基因的扩增率约30%，对其复发及生存期有较好的预测作用[23]。另外在乳腺癌研究中发现C-myc的表达与乳腺癌的病理分级、病理分型及淋巴结转移密切相关，是乳腺癌重要的独立预后因子[24]。本研究结果显示C-myc蛋白主要定位于细胞核，呈棕褐色颗粒。EOC组织中表达率为53.9%高于正常卵巢组织15.4%，差异具有统计学意义。C-myc在FIGO分期中Ⅲ~Ⅳ期的阳性表达率为73.1%，在Ⅰ~Ⅱ期为51.0%，差异具有统计学意义，与Sawant等[25]观点一致。而且还发现其表达与卵巢癌的分化程度、T 分期有关（P＜0.05），但与年龄、病理分型、淋巴结转移、远处转移等不相关。由此看出C-myc的高表达与EOC肿瘤TNM分期、分化程度及T分期确切有关，C-myc表达越高肿瘤分化程度越低，T分期越高，其同样有望成为评价EOC 分期及T分级的一个有价值的指标。
目前，对ZEB2和C-myc在EOC中的浸润、转移及临床病理中表达中的相互关系的研究国内外尚未见文献报道。C-myc影响着细胞的生长、分化、凋亡和细胞周期的进程[26]，其异常表达在癌变过程中是较早出现的分子改变，与肿瘤的启动及癌性增生有着密切的关系[27]。C-myc对细胞具有双重作用，既可刺激细胞增殖，亦可促进细胞凋亡。C-myc是刺激细胞增殖还是促进细胞凋亡受到多种因素的影响，包括基因、细胞因子、寡核苷酸、多种蛋白、蛋白酶体抑制剂、miRNA以及C-myc自身因素等等[28-29]。本研究对191例EOC组织中的ZEB2和C-myc表达进项了检测，发现ZEB2与C-myc蛋白表达的共阴性率为58.8%（57/97），共阳性率为67.0%（63/94），两者表达具有正相关性（相关系数R=0.358，P＜0.001），其在EOC 发生、进展中可能具有协同作用。ZEB2和C-myc在T分期中两者共同表达具有较好相关性（P＜0.001），并且在EOC早期即有较高的阳性表达率（40.7%，35/86）。同时我们发现两者在肿瘤FIGO分期中的共同表达率具有较明显的相关性（P=0.008），并且随着肿瘤分期越高，两者的共同表达阳性率越高（Ⅲ~Ⅳ vs Ⅰ~Ⅱ 82.4% vs 47.6%），但与年龄、病理分型、T分级、远处转移无明显相关性。
目前，关于ZEB2 和C-myc在EOC的增殖、侵袭、转移的研究仍然缺少丰富的实验和临床资料，本实验首次探索了二者之间在EOC临床病理表达的的联系，观察分析两者在EOC组织中的表达情况，研究发现两者的表达在EOC中具有协同性，对EOC的发生、发展起重要作用，肿瘤TNM分期越高，其表达一致性越高，并且在EOC早期两者具有较高的共同表达阳性率，故两者联合检测有望成为EOC早期诊断的重要指标。
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