缺血性脑卒中是脑卒中的主要形式^[1]，具有高致残率和高致死率的特点，严重威胁着人类的健康，且围手术期患者的脑缺血再灌注（I/R）损伤十分常见。丙泊酚作为一种临床常用的麻醉药近年来被证实对肾脏、肝脏、心脏的缺血性损伤都有一定的保护作用^[2-3]。研究发现，丙泊酚预处理能够减轻脑缺血再灌注损伤，但作用机制并不完全清楚，仍有待进一步深入探讨^[4]。缝隙连接（GJ）是细胞中广泛存在的一种特殊连接通道，在脑组织中以缝隙连接蛋白43（Cx43）组成的缝隙连接最为多见^[5]，研究表明，抑制缝隙连接（GJ）功能可以减轻脑缺血再灌注损伤^[6]，且有研究发现，丙泊酚可通过抑制缝隙连接功能降低原位肝移植导致的急性肾损伤^[7]。但丙泊酚对脑缺血再灌注损伤的保护作用是否与抑制GJ 功能有关，尚不明确。B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）家族的 Bcl-2、Bax基因组成一个平衡体系，共同参与脑缺血再灌注损伤的细胞凋亡过程，有文献报道丙泊酚可降低缺血再灌注脑损伤大鼠海马区凋亡因子Bax的表达，提高抑制凋亡因子Bcl-2的表达，对缺血再灌注脑损伤有一定保护作用^[8]；研究发现，调控缝隙连接功能可以通过影响Bax、Bcl-2的蛋白表达从而对肿瘤细胞的凋亡产生影响^[9]。但丙泊酚影响Bax、Bcl-2的蛋白表达是否与其抑制缝隙连接功能有关，尚未见报道。本实验中采用缝隙连接抑制剂甘珀酸（CBX）作为研究整体动物缝隙连接功能的工具药，旨在研究GJ在丙泊酚对大鼠脑I/R损伤保护中的作用，并对其可能机制进行初步探讨。

SPF级雄性SD大鼠70只，体质量300 ±20 g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号： SCXK（浙）2014-0001。

丙泊酚购于四川国瑞药业有限公司 （产品批号1403291）；PKC 单克隆抗体购于Abcam； Bax、Bcl-2 单克隆抗体购于BOSTER；Cx43 单克隆抗体、TTC（2,3,5,-氯三苯基四氮唑）、GAPDH单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG 二抗、山羊抗兔Ig G二抗均购于 Sigma；其他试剂均为国产分析纯级。

将70 只大鼠随机分为7 组，每组10 只：假手术（sham）组、缺血再灌注（I/R）组、丙泊酚低剂量（P₂₅，25 mg/kg）组、中剂量（P₅₀，50 mg/kg）组、高剂量 （P₁₀₀，100 mg/kg）组、甘珀酸（CBX）干预缺血再灌注（I/ R+CBX）组和甘珀酸干预丙泊酚高剂量（P₁₀₀+CBX）组。

参照Zea-land^[10] 法稍作改进制备大鼠局灶性I/R 模型。使用直径为 0.28~0.32 mm的线栓阻断大鼠大脑中动脉血流，造成大鼠局灶性脑缺血，缺血2 h后拔出线栓，恢复血流再灌注24 h，即I/R损伤模型。sham组只进行手术操作，但不插入线栓阻断大脑中动脉血流。相应剂量的丙泊酚（25、 50、100 mg/kg）于脑缺血前10 min经腹腔注射给药；甘珀酸（0.2 mg/kg）于再灌注前1 min尾静脉注射给药。

按照文献报道的神经行为功能缺失的评分方法^[11]，对再灌注24 h后的大鼠神经功能行为进行评分（每组10只）。0分：无可见的明显神经功能缺失症状，活动正常；1分：不能完全伸展手术对侧前肢； 2分：行走时向手术对侧转圈；3分：行走时向手术对侧倾倒，行动不便；4分：不能行走、意识水平下降或处于昏迷状态。其中神经行为评分≥1分为成功模型。

再灌注24 h后，立即断头取出脑组织（每组6只），置于-20 ℃冰箱冷冻12 min后自额极向后连续等距切取6张冠状脑片。1% TTC避光染色 30 min（37 ℃），正常脑组织染为红色，脑梗死区域为白色。染色后将脑片置于4%多聚甲醛溶液中保存24 h，逐层拍照。采用Image J软件对脑片相应部位面积进行测量，使用公式：脑梗死体积百分率/%=100%×{对侧大脑皮质的面积-[同侧大脑皮质的面积-脑梗塞的面积]}/ 对侧大脑皮质的面积^[12]，计算脑梗死体积百分率。

大鼠再灌注24 h后，立即断头取脑（每组4只），夹取大鼠右侧缺血区脑组织，提取蛋白，进行标准蛋白定量；制备12% SDS-PAGE凝胶，取50 μg/孔蛋白样品进行上样、电泳 （70 V,400 mA,30 min；95 V,400 mA,120 min）；转膜 （50 V,250 mA,150 min）；洗膜、封闭2 h；洗膜、与Cx43 （1∶2000）、PKC（1∶1000）、Bax（1∶2000）、Bcl-2（1∶1000） 共同孵育，4 ℃恒温过夜；洗涤后于左右摇床上室温孵育二抗（山羊抗鼠抗体：1∶5000；山羊抗兔抗体：1∶5000） 2 h。其中GAPDH（1∶2000）单克隆抗体室温孵育两小时即可。二抗孵育2 h后，采用ECL发光试剂盒发光、 显影，使用凝胶图像分析系统采集图像，图像采集后使用Bio Imaging system（Gene Genius）对图像进行灰度扫描分析。

采用SPSS 17.0软件分析实验结果，数据资料以均数±标准差表示，计量资料比较进行单因素ANOVA分析，P＜0.05认为有统计学意义，统计图采用Sigma Plot 10.0绘制。

大鼠脑缺血2 h，再灌注24 h后，对大鼠进行神经行为学评分，其结果为：sham 组大鼠无神经功能缺失症状，I/R 组神经行为学评分为2.90±0.57，P₂₅组为2.80± 0.42，P₅₀组为2.40±0.70，P₁₀₀组为2.80±0.42，I/R+CBX 组为1.70±0.67，P₁₀₀+CBX组为1.30±0.48。以上神经行为学评分结果显示：与I/R组相比，丙泊酚中、高剂量组神经功能缺损评分均显著降低（P＜0.05），且高剂量组降低效果更明显，但低剂量组无显著性差异。与异丙酚高剂量组相比，甘珀酸干预丙泊酚高剂量组大鼠的神经行为学评分进一步降低（P＜0.05）。

大鼠脑组织TTC染色后，脑组织梗死区域呈白色，非梗死区域呈红色，结果显示：sham组无明显梗死灶外，其他各实验组均出现不同程度的梗死灶。丙泊酚中、高剂量组较I/R组脑梗死体积均显著缩小（P＜0.05），且高剂量组缩小效果更加显著（P＜0.05），但丙泊酚低剂量组无显著性差异；在丙泊酚高剂量的基础上，加用甘珀酸，大鼠脑梗死体积进一步缩小（P＜0.05，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 丙泊酚对脑缺血再灌注损伤后大鼠的脑梗死体积的影响 Figure 1 Effect of propofol on brain infarct volume in rats with focal cerebral I/R injury detected by TTC staining. A: Slices of brain tissue. a: Sham; b: I/R; c: P25; d: P50; e: P100; f: I/R + CBX; g: P100 + CBX. B: Quantitative analysis of brain infarct volume (n=6). Bars are standard deviation. #P＜0.05 vs I/R group. *P＜0.05 vs P100 group.

由神经行为学评分和TTC染色结果可知，丙泊酚高剂量对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用最佳，因此选用丙泊酚高剂量（100 mg/kg）用于后续机制研究的实验。采用Western blot检测Cx43、PKC蛋白表达变化。 结果显示：与sham组相比，I/R组Cx43蛋白表达显著增高（P＜0.05）；丙泊酚高剂量组较I/R组Cx43蛋白表达显著降低（P＜0.05）；甘珀酸干预丙泊酚高剂量组较丙泊酚高剂量组Cx43蛋白表达进一步降低（P＜0.05）。各组大鼠的PKC蛋白表达趋势与Cx43蛋白表达趋势相反（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 丙泊酚对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中Cx43和PKC 蛋白表达的影响 Figure 2 Effect of propofol on the expression of Cx43 and PKC in rats with cerebral I/R injury detected by Western blotting. A: Expression of Cx43 and PKC. 1: sham; 2: I/R; 3: P100; 4: I/R+CBX; 5: P100 +CBX; B: Quantitative analysis of Cx43; C: Quantitative analysis of PKC (n=4); Bars indicate standard deviation. *P＜0.05 vs sham group. #P＜0.05 vs I/R group. △P＜0.05 vs P100 group.

采用Western blot 检测Bax、Bcl-2 的蛋白表达变化，结果显示：I/R 组Bax/Bcl-2 的比值较sham 组明显增加（P＜0.05）；丙泊酚高剂量预处理后可显著降低脑缺血再灌注损伤Bax/Bcl-2的比值（P＜0.05）；且CBX可使丙泊酚高剂量组Bax/Bcl-2 的比值进一步降低（P＜0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 丙泊酚对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中Bax和Bcl-2 蛋白表达的影响 Figure 3 Effect of propofol on the expression of Bax and Bcl-2 in rats with cerebral I/R injury detected by Western blotting. A: Expression of Bax and Bcl-2. 1: sham; 2: I/R; 3: P100; 4: I/R + CBX; 5: P100 + CBX. B: Quantitative analysis of the Bax/Bcl-2 (n=4); Bars indicate standard deviation. *P＜0.05 vs sham group. #P＜0.05 vs I/R group. △P＜0.05 vs P100 group.

丙泊酚作为一种静脉麻醉药，具有类维生素E的结构，有抗脂质过氧化的作用；其药代动力学特征为起效快、停药恢复快，因此广泛应用于临床麻醉的诱导和维持。近年来，多个研究^[13-15]表明丙泊酚可以减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，但其作用机制尚不完全清楚。本实验通过神经行为学评分和TTC染色结果证实丙泊酚对I/ R损伤有一定的保护作用，且高剂量效果较佳，与其他研究者的发现^[16]保持一致，因此本实验选用保护作用效果较佳的高剂量丙泊酚（100 mg/kg）进行后续的机制研究。研究发现，脑缺血再灌注过程中GJ功能有明显的增强，抑制GJ功能脑I/R损伤显著降低^[7]。CBX具有抑制GJ的功能，且起效快、能通过血脑屏障，可以用于对整体动物缝隙连接功能的研究。从本实验神经功能评分、TTC染色结果可以看出，丙泊酚和CBX都可以降低I/R 损伤，且CBX可使丙泊酚的保护作用增强。 Western blot结果显示，I/R组Cx43蛋白表达较sham组明显增加，丙泊酚可显著降低Cx43蛋白表达，且CBX 可使丙泊酚组Cx43蛋白表达进一步降低。说明丙泊酚的保护作用与抑制缝隙连接功能有关。

缝隙连接（GJ）通道是由两个缝隙连接半通道对接而成，而每个缝隙连接半通道是由六个缝隙连接蛋白 （Cx）组成的六聚体构成。有文献报道，GJ在同步细胞的活动、维持细胞内环境稳定、控制细胞的生长和发育等生命过程中发挥十分重要的作用^[17]。脑组织中分布最为广泛的是Cx43蛋白^[18]，因此本实验以Cx43为研究缝隙连接功能的主要对象。近年来，有研究发现，Cx43蛋白可以作为治疗缺血再灌注损伤的新靶点^[19]，其作用日益受到研究者们的关注。本实验中，I/R 组 Cx43蛋白表达高于sham组；P₁₀₀组Cx43蛋白表达低于 I/R组；P₁₀₀+CBX组Cx43蛋白表达低于I/R+P₃组。说明抑制Cx43蛋白表达可以降低脑I/R损伤，且丙泊酚可以通过抑制Cx43的蛋白表达从而减轻I/R损伤；CBX 可以使P₁₀₀组的Cx43蛋白表达进一步降低，I/R损伤得以进一步减轻。

PKC激酶属于多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛调节各个细胞的生理功能，参与缺血再灌注损伤等疾病的发生、发展过程^[20]。PKC可以磷酸化Cx43蛋白的特殊位点，从而降低GJ功能^[21]。因此本实验观察了丙泊酚处理后PKC 与Cx43 蛋白之间的关系，结果显示，与 sham组相比，I/R组中PKC蛋白显著降低，P₃组的PKC 蛋白的表达高于I/R组，CBX可以使P₁₀₀组的PKC蛋白表达进一步增高，说明PKC蛋白可能参与了丙泊酚抑制缝隙连接功能从而降低I/R损伤的过程。B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）家族的Bcl-2、Bax基因组成一个平衡体系，共同参与脑I/R损伤过程中由于活性氧过度释放引起的细胞凋亡^[22]。其中抗凋亡基因Bcl-2与抑制细胞凋亡、延长细胞生存有关；而促凋亡基因Bax表达增高时可促进细胞凋亡。因此，研究者采用Bax/Bcl-2的比值作为评价细胞凋亡的一个重要标志^[23]。Western blot 结果显示，I/R组Bax/Bcl-2的比值较sham组明显增加，丙泊酚预处理可显著降低脑缺血再灌注损伤Bax/Bcl-2 的比值，且CBX可使丙泊酚组Bax/Bcl-2的比值进一步降低。

综上所述，丙泊酚预处理可减轻I/R损伤，其机制可能与通过影响PKC蛋白表达从而抑制缝隙连接功能及降低Bax/Bcl-2的比值有关。