癌相关成纤维细胞（CAFs）是构成肿瘤微环境中的的主要部分，可以分泌多种细胞因子促进与肿瘤细胞生长、侵袭等^[1-2]。近期的研究表明，CAFs具有独特的代谢方式，即CAFs通过糖酵解方式将葡萄糖转化为乳酸，供给其周围的肿瘤细胞；而肿瘤细胞则直接用乳酸进行三羧酸循环（TCA），并且高乳酸的酸性环境也促进肿瘤细胞的侵袭^[3-4]。miRNA是一类大小为20~25 个核苷酸的非编码小RNA，参与调节细胞多种生理病理过程^[5]。miR-181 家族包括同源的miR-181a、miR-181b、 miR-181c 和miR-181d 等，研究表明其在细胞的增殖、 肿瘤的侵袭等方面具有抑制作用^[6]。那么miR-181家族在细胞糖酵解中的作用尚不可知，因此本实验将在原代CAFs上探讨miR-181家族在糖酵解中的作用和机制。

细胞培养基DMEM及血清（Life，美国），HK2一抗（Abcam，美国），β-actin 一抗（中杉金桥生物公司，北京），Lipofectamine^TM 2000（Life，美国），PrimeScript^TM RT Master Mix（Taraka，日本），SYBR GREEN（Roche，美国），乳酸检测试剂盒（Biovision，美国）。

参考Ji等^[7]方法分离培养成纤维细胞。获取手术新鲜癌旁及距离癌组织5 cm外肺组织标本，含1%双抗的PBS灌洗肺组织，用组织剪将肺组织剪成1 mm×1 mm× mm碎组织，均匀铺在培养瓶底部，倒置培养瓶，加入3 mL含10% FBS的培养基，置于细胞培养箱中培养12 h 后轻柔翻转培养瓶，继续培养。10 d后显微镜下观察并拍照。

Mimics-miRNA、inhibitor-miRNA、siRNA和vector 由广州锐博生物公司合成，转染过程参考Lipofectamine^TM 2000说明进行。

收集细胞，加入细胞裂解液匀浆，裂解30 min 后15 000 r/min、4 ℃，离心15 min，收集细胞上清，检测浓度。10%胶电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h，HK2一抗1:1000，4 ℃摇床过夜，孵二抗，显影。

根据Fischer等^[8]的报道，根据细胞对[³H]-2DG摄取量来反映其对葡萄糖的摄取率。无血清条件下培养24 h 后换为低糖DMEM培养液，同时加入37 kBq/mL[³H]-2DG 继续培养24 h。消化细胞后留小部分细胞计数，其他用0.5ol/L 氢氧化钠裂解细胞15 min 后，加入同体积0.5 mol/L盐酸中和。用酶标仪检测细胞裂解液的dpm 值。（心肌细胞总放射活性-非特异性结合的放射活性）/ 24 h/细胞数即得出心肌细胞[³H]-2DG摄取量。

12 孔板细胞PBS洗1 次，更换无酚红培养基培养20 h 后，收集上清后按乳酸检测试剂盒说明书检测，DRY-CHEM FDC3500分析仪检测乳酸含量；同时，消化细胞作细胞计数。最终结果为每106细胞产生乳酸量。

参考Nohata等^[9]的方法，运用Applied Biosystems 公司miR-181 家族检测试剂盒（TaqMan MicroRNA Assays；Assay ID：000480，001098，000482，001099）检测miR-181家族表达水平。

参考Hidaka等^[10]的方法，在24孔板中加入PLB裂解液100 μL，常温下裂解30 min后收集于一干净的EP 管中。将样品加入白色96 孔板中，加入Luciferase Assay Buffer II 后酶标仪检测荧光值Luc1，再加入Stop&Glo® Buffer 检测荧光值Luc2。Luc1/Luc2 即为检测值。

应用SPSS 13.0统计学软件，采用One-wayANOVA 方差分析法，首先利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较，多重比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

分离原代成纤维细胞，10 d后镜下观察细胞形态，NFs和CAFs都成长梭形，两者在镜下无明显不同（图1A）。进一步检测糖摄取和细胞培养基中乳酸水平，结果可见CAFs组糖摄取和乳酸产生都较NFs组明显增加（图1B、C）。miR-181家族表达水平，CAFs组较NFs 组明显减少（图1D），其中miR-181c减少较为明显。由此可见，CAFs中糖酵解明显增加，可能与miR-181c减少有关。

图 1(Figure 1)

图 1 CAFs中糖酵解水平和miR-181家族表达的情况 Figure 1 Glycolysis level and expression of miR-181 family in CAFs. A: NFs and CAFs under inverted microscope (Original magnification: ×200); B: Glucose uptake assessed by 2-NBDG; C: Lactate levels in the culture media determined with lactate Assay Kits (normalized with cell number); D: Q-PCR for analyzing expressions of mir-181 family. *P<0.05 vs NFs group.

在糖酵解增多的CAFs中miR-181 家族表达水平明显减少，为进一步明确两者之间的关系，我们通过转染miR-181家族的小片段mimics或抑制片段inhibitor 到细胞中。结果显示，在NFs细胞中转染miR-181家族的inhibitor，其葡萄糖摄取和培养基中乳酸水平明显增加（图2A、B）；另一方面，CAFs 转染miR-181 家族的mimics后，其葡萄糖摄取和培养基中乳酸水平明显减少（图2C、D）。由此可以推测，miR-181家族参与成纤维细胞糖酵解途径的调控，其中以miR-181c的作用较为明显。

图 2(Figure 2)

图 2 miR-181对成纤维细胞糖酵解的影响 Figure 2 Effects of miR-181 family on glycolysis of fibroblasts.Glucose uptake was assessed by 2-NBDG in NFs (A) and CAFs (C); the lactate levels in the culture media were determined in NFs (B) and CAFs (D). *P<0.05 negative control (NC) group.

通过生物信息学网站（http://www.microrna.org）及相关文献预测miR-181c调控的与糖代谢相关的靶向基因。己糖激酶2（hexokinase-2，HK2）是催化己糖使之磷酸化的酶，它是糖酵解途径的第1个酶，也是糖酵解途径的限速酶。我们对比了NFs 和CAFs 细胞匀浆中HK2的表达，发现CAFs中HK2的表达较NFs明显增加（图3）。在高表达miR-181c 的NFs 中转染inhibitor- 181c 后，HK2 的表达明显增加；相反，在低表达miR- 181c 的CAFs 转染mimics-181c 后，HK2 表达明显降低。为进一步明确miR-181c的靶点，我们通过信息学分析预测miR-181c在HK2 mRNA靶点并将其进行突变。荧光素酶报告基因系统检测结果显示，miR-181c 可以减少野生型（WT）质粒荧光素酶的荧光，对突变型（MUT）没有影响。以上结果显示，miR-181c可以靶向HK2 mRNA下调HK2蛋白表达。

图 3(Figure 3)

图 3 miR-181c靶向HK2 mRNA对HK2蛋白表达的影响 Figure 3 Effect of miR-181c on expression of HK2 protein by targeting HK2 mRNA. A: Expression of HK2 protein determined by Western blotting in NFs and CAFs (*P<0.05); B: Expression of HK2 protein in NFs transfected with inhibitor-181c and mimcs-181 (*P<0.05 vs NC group); C: Wild type (WT) and mutation (MUT) of sequences in the 3'UTR of HK2 targeted by miR-181c. The boxed sequences are complementary to the seed sequence of miR-181c; D: Luciferase reporter gene activity in CAFs (*P<0.05 vs NC group).

虽然HK2可以促进糖酵解，并且miR-181c有抑制HK2 蛋白表达的作用，但是mic-181c 是否通过抑制HK2来抑制细胞糖酵解，还需进一步验证。通过siRNA 技术，在敲低HK2的CAFs细胞中（图4A）转染mimics- 181c，结果显示敲低HK2后，CAFs细胞葡萄糖摄取和细胞培养基中乳酸水平明显减少（图4B、C），但是mimics-181c不能进一步减少CAFs细胞葡萄糖摄取和细胞培养基中乳酸水平（图4B、C）。另一方面，我们在低表达HK2的NFs中过表达HK2（图D），其葡萄糖摄取和细胞培养基中乳酸水平明显增加（图4E、F），进一步转染mimics-181c 后，过表达的HK2 减少（图D），同时葡萄糖摄取和细胞培养基中乳酸水平明显也较过表达HK2组明显减少（图4E、F）。由此可见，miR-181c是通过抑制HK2的表达来抑制细胞糖酵解。

图 4(Figure 4)

图 4 miR-181c抑制HK2的表达对进细胞糖酵解的影响 Figure 4 iR-181c suppressed glycolysis through down-regulation of HK2. Western blot was used to determine the expression of HK2 in CAFs transfected with siRNA (A) and in NFs transfected with vector-HK2 and mimics-181c (D); Glucose uptake was assessed by 2-NBDG in CAFs (B) and NFs (E); the lactate levels in culture media were determined in CAFs (C) and NFs (F). *P<0.05 negative control (NC) group.

CAFs是癌组织周围呈激活状态的成纤维细胞^[11-12]。较之正常的成纤维细胞（NFs），CAFs的代谢方式也具有独特性。有研究^[13]表明CAFs与癌细胞的代谢耦联方式比较符合于“反瓦伯格效应”，主要表现为：CAFs的线粒体功能严重受损，迫使CAFs使用糖酵解的方式进行代谢，大量产生的乳酸盐被癌细胞摄取和利用，为癌细胞的生长提供能量^[8]。另外CAFs产生的乳酸盐还能刺激癌细胞的线粒体，使其氧化磷酸化反应增强。并且，糖酵解产生的乳酸排出到胞外形成酸性环境，有利于肿瘤细胞对周围组织的侵袭^[14-15]。我们的结果也显示，在原代CAFs的糖摄取和培养基中乳酸水平较NFs 明显增加。

MicroRNA是细胞内重要生理调控机制之一。越来越多的研究表明，microRNA细胞的糖代谢调节，特别的糖酵解发挥重要作用^[16-17]。在分离的原代CAFs 中，有抑制肿瘤作用的miR-181 家族表达水平明显下降。我们进一步在CAFs 中转染miR-181 家族的mimics，发现CAFs 的糖酵解受到明显抑制；相反，在NFs细胞中转染miR-181家族的inhibitor，能够增加其的糖酵解水平。由此可见，miR-181家族参与了CAFs的糖酵解调控。

为了明确miR-181家族调控糖酵解的机制，通过生物信息学分析，发现miR-181家族中抑制糖酵解效果较好的miR-181c可以靶向糖酵解限速酶HK2（己糖激酶2，hexokinase-2）mRNA的3'UTR。在CAFs 细胞中增加miR-181c表达后，HK2蛋白表达水平明显减少。通过荧光素酶报告基因系统进一步检测，发现miR-181c 靶向的mRNA位点发生突变后，miR-181c对其没有明显的抑制作用。我们可以推测，miR-181c可以靶向HK2 mRNA的3'UTR，抑制其蛋白翻译。那么，miR-181c 是否通过抑制HK2 的蛋白水平来减少糖酵解的。敲低CAFs 细胞HK2 蛋白水平后，再转染mimics-181c 后，miR-181c 无明显的抑制糖酵解作用；另一方面，miR-181c却可以抑制NFs过表达HK2后糖酵解增加，同时减少HK2 的蛋白水平。因此，我们推测miR-181 家族是通过抑制HK2的蛋白水平来减少糖酵解。

综上所述，miR-181c有明显的抑制CAFs糖酵解作用，其机制可能是通过抑制糖酵解限速酶HK2蛋白的翻译，这为临床治疗肿瘤提供了一个新的思路。