由HIV感染引发的艾滋病（AIDS）导致每年数百万人死亡。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）应用于早期感染的患者，可有效抑制HIV感染，控制病毒血症，通过持续服药可有效延长感染者寿命^[1]。然而患者一旦停止服药，HIV便再次活化并产生甚至更为严重的病毒血症^[2]。研究发现HIV 的潜伏感染是HAART根治HIV最大的障碍^[3]。潜藏于机体静息期免疫细胞（如记忆性T细胞，纯真CD4⁺ T细胞，神经胶质细胞，星形胶质细胞等）中的HIV因无法被机体免疫细胞识别并清除，成为HIV 难以治愈的根本原因^[4]。“激活再杀灭（shock and kill）”策略提出的理念在于尝试采用小分子化合物与HAART联合使用从而达到彻底清除HIV的目的^[5]。采用激活剂激活隐藏的HIV，从而使得机体的免疫细胞可特异性识别活化的细胞并清除，同时采用HAART治疗，可杀灭释放出来的HIV 颗粒防止其再次感染和复制。

目前，多种“激活再杀灭”联合用药模式正在临床试验当中^[6]。寻找高效激活潜伏HIV小分子化合物成为当前亟待解决的问题，近年来研究发现植物来源的萜类化合物prostratin具有较强激活潜伏HIV作用^[7]。中药材狼毒大戟具有治疗淋巴结结核，骨结核，皮肤结核，牛皮癣，神经性皮炎，慢性支气管炎，阴道滴虫等多种功效，在我国黑龙江、辽宁、内蒙古、河北等地均可生长，分布广泛，其提取物中的萜类化合物在抗肿瘤领域和潜伏HIV激活领域获得广泛关注^[8-9]。本文通过改进的丙酮一步法高效提取了狼毒大戟萜类化合物，通过MS、 HPLC分析鉴定该类化合物为prostratin及其类似物或衍生物，通过激活潜伏HIV细胞（J-Lat 10.6）实验，证明了该类化合物具有显著的潜伏HIV激活活性，并揭示其激活的分子机制。

狼毒大戟植物购自辽宁葫芦岛，潜伏HIV细胞系J-Lat 10.6由复旦大学病原微生物研究所馈赠。澳洲胎牛血清及RMPI 1640培养基均购自美国Gibco，核蛋白抽提试剂盒购自美国Thermo Fisher Pierce，蛋白酶抑制剂混合物及磷酸酶抑制剂混合物购于美国Merk calbiochem。ECL发光液，p65 兔mAb，p24，Lamin A/C鼠mAb以及羊抗兔和羊抗鼠二抗均购自美国CST，prostratin 标准品购自美国SIGMA-Aldrich。提取用丙酮为分析纯，高效液相色谱仪流动相用甲醇为色谱纯。

药材粉碎机，超声仪，冷冻干燥机（Thermo SNL216V），高效液相色谱仪（岛津LC-10AT），质谱仪（WATERS 2695），台式低温离心机（Eppendorf 5810R）细胞培养箱（Thermo Forma Series II），荧光显微镜（Nikon Elipse Ti），流式细胞仪（BD FACS Canto II），电泳仪（Bio-Rad）。

采购的新鲜狼毒大戟根部，用刀切成块状，浇液氮迅速冷冻，并立刻置于药材粉碎机粉碎成末状。将狼毒大戟粉末置于冷冻干燥机，使之充分去除水分，3 d后取出，称重。将预干燥狼毒大戟干粉1 g溶于25 mL丙酮，混匀，100 HZ超声10 min，55 ℃水浴1 h。真空过滤，除去滤渣，获得丙酮溶解部分。真空旋转蒸发1.5 h左右，使丙酮挥发，浓缩至底部为黄褐色油状物为止，加入200 μL DMSO溶解，保存于-20 ℃待检测。

提取物经0.22 μm滤膜过滤后，上质谱分析，同时prostratin 标准品用DMSO溶解作为对照。质谱鉴定提取物中的目标化合物后，采用HPLC分析，过C₁₈柱，以甲醇/水为流动相，按照25%甲醇2 min，35%甲醇6 min，80%甲醇10 min 的程序梯度洗脱，记录保留时间和峰高并收集目标单峰，同时以prostratin 标准品作对照制作标准曲线，计算提取物中的活性化合物浓度。

J-Lat 10.6细胞用添加10%胎牛血清和1% 双抗的RPMI 1640培养基来进行培养，置于5% CO₂培养箱中，每隔3 d传代1次。取对数生长期J-Lat 10.6细胞，800 r/min离心5 min收集细胞，调整浓度为5×10⁵个细胞/mL，0.5 mL培养液/孔均匀接种于48孔板中，以50 μg/mL EFE刺激细胞，未加药物组作为阴性对照，以10 ng/mL TNF-α做阳性对照。24 h后，置于荧光显微镜（放大倍数10×10）下，蓝光激发，并拍摄图片。随后，转移细胞培养液于流式管中，800 r/min离心5 min收集细胞，去除上清后，用500 μL PBS洗1次，将细胞重悬于300 μL PBS中，上流式细胞仪检测，计算GFP阳性比例。抑制实验分别以50 μg/mL EFE合用2.5、5、10 μmol/L的BAY 11-7082，同法操作。

J-Lat 10.6调整细胞浓度为2×10⁶个细胞/mL，2 mL/孔接种于6 孔板中，分别加50 μg/mL EFE 刺激0.5、1 、2 h 或添加相应浓度BAY 11-7082并以未加药组作为阴性对照。4 ℃，500 g离心5min收集细胞于EP管中，在试剂盒细胞裂解液CER及NER中分别添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，按照试剂盒操作步骤依次去除胞质并抽提核蛋白。或种板后分别在3、6、12、24 h加50 μg/mL EFE 与添加相应浓度BAY 11-7082后提取总蛋白。蛋白定量后，加入上样缓冲液，将样品置于100 ℃加热5 min使蛋白变性。随后每孔上样20 μL（1 μg/μL）蛋白，经10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳100 min 分离，再将蛋白转印于PVDF 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h 后，p65，β-actin兔抗人单克隆抗体及p24、Lamin A/C鼠抗人单克隆抗体1:1000稀释于5% 脱脂奶粉中，置于4 ℃摇床孵育过夜。第2天将膜取出，用PBS-T（含0.1% Tween 20）清洗3遍后与羊抗兔及羊抗鼠二抗室温共孵1 h，清洗5遍后用ECL发光液发光并显影。

流式数据分析均采用FlowJo 7.6分析软件来进行处理，GFP百分率采用prism 5 作图软件作图，误差线均用均数±标准差来表示。荧光图片及WB 图片运用adobe photoshop CS5处理。WB条带灰度值采用ImageJ2X软件来分析。

根据化合物prostratin结构（图1）分析，采用步法从狼毒大戟粉末中提取得到的样品浓缩后溶于DMSO，通过质谱检测，以标准品prostratin 作为对照，鉴定出粗提物中含有prostratin及prostratin类似物。采用ESI（+）-MS，检测到M+23（Na）离子峰，质谱结果（图2）如下。

图 1(Figure 1)

图 1 Prostratin的化学结构（相对分子质 量390.47） Figure 1 Cchemical structure of prostratin, C22H30O6 , M.W. 390.47.

图 2(Figure 2)

图 2 Prostratin标准品及丙酮提取物的质谱图 Figure 2 Mass spectrogram of prostratin standard control (A) and acetone extract of Euphorbia fischeriana (B).

丙酮提取物过C₁₈ 反相柱高效液相色谱仪，用甲醇作流动相来进行梯度洗脱，以prostratin 标准品作对照，记录保留时间及峰面积。以0、0.025、0.5、0.1、 0.2 mmol/L prostratin标准品做标准曲线（R²=0.99）。通过标准曲线计算，得到丙酮提取物中活性组分prostratin 浓度约为0.53 mmol/L。

J-Lat 10.6是一株HIV潜伏细胞系，多用于激活化合物的筛选，插入HIV基因组中的GFP基因随HIV基因组整合于细胞中并处于潜伏状态，药物作用后GFP的表达水平即代表HIV的激活水平。用50 μg/mL EFE刺激24 h后，在荧光显微镜下观察并拍照，结果如图（图3）所示。对应流式检测结果如图4。结果显示在药物作用下，GFP水平明显上调，说明EFE 能显著激活潜伏HIV。

图 3(Figure 3)

图 3 EFE处理后对J-Lat 10.6细胞GFP的影响左为阴性对照，右为药物处理组 Figure 3 Fluorescent images of GFP cells. The left is negative control; the right is J-Lat 10.6 cells treated with EFE.

图 4(Figure 4)

图 4 EFE对潜伏HIV的激活效果 Figure 4 Activity of EFE in reactivating latent HIV. A, B: Flow cytometry analysis of GFP subset; C: Statistics of GFP %. ***P< 0.01 vs control Group.

EFE刺激潜伏细胞的同时，采用2.5、5、10 μmol/L BAY 11-7082处理细胞24 h后，检测GFP阳性率，抑制结果如图5所示。结果显示BAY 11-7082呈浓度依赖方式抑制EFE激活潜伏HIV的作用，间接证明EFE激活潜伏HIV受到NF-κB通路调控。药物处理不同时间点提取核蛋白或总蛋白，用WB检测，蛋白印迹图片（图6）显示随着时间变化，p65 核内水平显著上调，且HIV 蛋白p24随着药物作用时间明显增加。为进一步确定EFE通过NF-κB 通路激活潜伏HIV，采用NF-κB 通路特异性抑制剂BAY 11-7082与EFE共同作用后（图7），发现其能够抑制EFE诱导的p65入核，同时抑制了p24 的生成。

图 5(Figure 5)

图 5 BAY 11-7082对EFE激活潜伏HIV在24 h产生 的抑制作用 Figure 5 Inhibitory effect of BAY 11-7082 on EFE shown by GFP% reduction. ***P<0.01 vs control Group.

图 6(Figure 6)

图 6 EFE对HIV蛋白和NF-κB通路的影响 Figure 6 Effect of EFE on p24 and NF-κB pathway. A: Nucleus protein level of p65 increased over time; B: HIV protein p24 increased apparently in 24 h.

图 7(Figure 7)

图 7 BAY 11-7082对EFE激活的抑制作用 Figure 7 Effect of BAY 11-7082 on HIV reactivation capacity of EFE. A: Nuclear accumulation of p65 was inhibited by BAY 11-7082; B: The expression of p24 mediated by EFE was inhibited by BAY 11-7082.

研究结果表明，药用植物狼毒大戟根部含有大量prostratin，采用丙酮一步法可高效提取，研究中采用MS 鉴定并通过HPLC测得含量。实验结果证明prostratin 能有效激活潜伏HIV，进一步探讨其激活潜伏HIV机制，发现其可通过激活NF-κB，诱导p65入核与DNA结合从而发挥转录激活作用。

狼毒大戟作为传统中药材，其适应病症与功效早有记载，因其毒性多作外用。在深入研究其活性组分的进程中^[9]，通过分离提取得到了多种萜类化合物：prostratin，phorbol，PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate），Phorbol 12,13,20-triacetate等。其中prostratin作为酪氨酸激酶抑制剂在抗肿瘤方面发挥重要疗效，近年来，又发现其有强烈的激活潜伏HIV的作用，具有良好的清除潜伏HIV实现HIV功能性治愈的前景^[10]。随着各研究领域对prostratin 的关注增多，研究人员也不再局限于从植物中提取，以phorbol为原料的半合成方法以及生物合成方法取得了突破性进展^[11-12]。然而，因其合成产率低以及合成难度大，依然不能改变prostratin价格昂贵的现状。本文中采用改进的丙酮一步法，可获得约40 μg/1 g 干重的高产率，在提取方法上与传统方法按化合物极性分步提取的方法相比较，具有快速，简便的优势，避免了多次分步提取导致的活性组分损失，同时也节约了大量时间和精力，充分体现了丙酮一步法的优势，不失为prostratin提取分离的优良方法^[13]。

目前，关于HIV潜伏的机制并不十分明晰，总结已发现激活剂的激活途径，可主要分为以下四类：以prostratin 为代表的PKC通路激活剂；以vorinostat为代表的HDAC抑制剂；以JQ1为代表的P-TEFb激活剂；以及以IL-7为代表的免疫功能调节剂^[14]。而后续深入研究发现PKC通路下游入核转录效应因子NF-κB在四类激活剂的激活效应中均发挥作用，成为HIV基因转录的关键因子^[15]。经典NF-κB通路在介导炎症，免疫反应，肿瘤生长和抑制方面得到了深入研究，其在药物诱导作用下通过多种通路活化并入核与DNA相结合，发挥启动转录特异基因的作用^[16]。文中采用提取的EFE作用于潜伏HIV细胞系J-Lat 10.6，发现其激活机制为促进p65入核从而发挥转录激活效应，充分论证了NF-κB通路在潜伏HIV激活过程中的关键作用。而在最新的研究中发现，非经典NF-κB通路在HIV的转录激活过程中同样发挥了非常关键的作用^[17-18]。

总之，传统中药材狼毒大戟根部提取组分具有良好的激活潜伏HIV活性，其药用价值和提取分离方法值得进行深入探究。NF-κB通路在炎症肿瘤等多种疾病的发生和发展中发挥了至关重要的作用，在潜伏HIV转录激活的过程中的作用仍然值得进一步探索。本文研究为解决prostratin的来源问题提供一定的可行性，并为激活潜伏HIV机制以及HIV的清除提供了理论基础。