急性肺损伤（ALI）由于多种病因导致毛细血管- 肺泡上皮屏障损害，大量富含蛋白的水肿液聚集在肺泡腔内，从而使正常的气体交换障碍。急性呼吸窘迫综合症（ARDS），是ALI进行性发展的严重阶段，病死率高达40%^[1]。有效地清除肺泡腔内聚集过多的水肿液是判断ALI/ARDS预后的重要因素^[2]。新近研究发现精氨酸抗利尿激素（AVP）能减轻ALI/ARDS肺部炎症反应，同时在肺水肿液重吸收中扮演着重要角色^[3-6]，但对肺水含量的影响及作用机制尚不清楚。

目前研究认为肺泡上皮钠通道（ENaC）和Na⁺，K⁺-ATPase是肺泡腔内钠水转运的重要环节，能有效地清除聚集的水肿液，对维持气体交换和改善氧合至关重要，其中以α-ENaC和α₁-Na⁺，K⁺-ATPase为关键通道蛋白^[7]。本研究通过大鼠ALI模型，观察精氨酸抗利尿激素对肺水肿液清除的影响并探讨其可能机制。

健康成年的雄性SD大鼠48 只（SPF 级），体质量300±25 g，由重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（渝）2007-0001。精氨酸抗利尿激素（AVP）购自American Regent 公司。脂多糖（LPS，E.coli，0111: B4）、戊巴比妥、Evans-blue购自Sigma公司。蛋白检测试剂购自南京凯基。α₁- 钠/钾ATP 酶（α₁-Na⁺ ，K⁺- ATPase）单克隆抗体购自Millipore公司。α-ENaC及β- 肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体购自Santa Cruz公司。

给予大鼠腹腔注射戊巴比妥50 mg·kg^-1麻醉后，至于解剖台上，逐层解剖分离，暴露右侧颈静脉，留置静脉插管。LPS以5 mg·kg^-1剂量通过颈静脉插管注入^[8]。48只SD大鼠随机分为对照组：通过微量泵经颈静脉泵入等量生理盐水；模型组：建立ALI模型，建模1 h后泵入等量生理盐水；AVP组：ALI模型建立1 h后持续泵入AVP 0.57 mU·kg^-1·min^-1。每组16只。每组大鼠在建立模型12 h后通过颈椎脱臼，断开脊髓处死，并收集标本。

大鼠处死后，取左肺上叶组织，置于10%甲醛溶液中固定后，石蜡包埋组织，苏木素-伊红（HE）染色，观察病理学改变。

取左肺下叶组织，称湿重后置于80 ℃烤箱中烘烤72 h，然后再称干重，计算肺湿/干重比，评估肺水含量。

结扎右侧主支气管，游离右肺组织，在室温下用接注射器的灌洗器通过左侧支气管向左肺组织注入0.9% 生理盐水5 mL，反复抽吸3 次后吸出，重复3 次，置于4℃离心机上14 000 r/min离心30 min，取上清液保存。从静脉导管收集血标本，置于4 ℃离心机上1500 r/min 离心20 min。依据蛋白检测试剂盒说明书测定支气管肺泡灌洗液（BALF)）和血浆中蛋白含量，计算BALF/血浆蛋白比值，评估肺泡上皮通透性^[9]。

参照文献^[10]的方法进行AFC测定。游离右肺组织并行气管插管，然后注入100%氮气，将含0.15 mg·mL^-1 Evans-blue标记的5%白蛋白等渗生理盐水（5 mL·kg^-1）经导管灌入大鼠左肺组织，机械通气1 h后测定肺泡内液体Evans-blue 标记的白蛋白浓度，根据公式：AFC= [（Vi-Vf）/Vi]×100%，Vf=（Vi×Pi）/Pf。Vi：起始注入肺泡内液体量，Vf：最后肺泡内液体量，Pi：起始注入的Evans-blue标记的白蛋白浓度，Pf：最后Evans-blue标记的白蛋白浓度。

取左肺下叶组织，石蜡包块，切片后先后依次置于二甲苯，不同浓度的乙醇及3% H₂O₂，室温下孵育10 min； 蒸馏水冲洗后，PBS浸泡6 min；牛血清室温封闭30 min； 4℃与稀释的一抗（α₁-Na⁺,K⁺-ATPase,α-ENaC）孵育过夜；PBS 冲洗3 次后，与生物素标记的二抗37 ℃孵育30 min；然后再与辣根酶标记抗生物素蛋白复合物反应30 min；DBA显色，苏木素复染，中性树胶封片。在高倍镜下随机选取5个视野观察，褐色颗粒为阳性结果，计算每个视野中阳性细胞数。

提取的组织蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移至硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉封闭1 h后，分别与α-ENaC（1:300）、 α₁-Na⁺，K⁺-ATPase（1:500）、β-actin（1:2000）反应，4 ℃ 孵育过夜。TBST洗膜3次后，再与辣根过氧化物酶标记的IgG反应，室温孵育2 h，ECL显色。BIO-RAD成像系统扫描，Quantity One软件分析条带吸光度值，以目的条带与β-actin比值作为结果进行比较。

所有数据以均数+标准差表示，运用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析或者student's-t检验，P<0.05 为差异具有显著性。

对照组为正常肺组织，未见明显的肺泡及间质水肿和炎性细胞浸润。与对照组比较，模型组肺泡及间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构破坏、出血，透明膜形成。与模型组比较，AVP组肺泡及间质水肿显著减轻，出血及肺泡结构破坏减轻，炎性细胞浸润减少，未见透明膜形成（图1）。

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠肺组织病理学 Figure 1 Histological changes of the lung in each group（HE,original magnification: ×10）.

与对照组比较，模型组肺水含量和肺泡上皮通透性显著增加（P<0.05）；AVP治疗后肺水含量和肺泡上皮通透性显著降低（P<0.05，表1）。

与对照组比较，模型组AFC显著降低52.9%（P< 0.05）；AVP治疗后，AFC显著增加187%（P<0.05，表1）。

表 1(Table 1)

表 1 肺水含量和肺泡上皮通透性 Table 1 Lung water content and alveolar permeability in each group (Mean±SD,n=8) Group Wet/dry ratio BALF/plasma protein ratio AFC（%） Control group 2.36±0.64 0.05±0.02 17.79±2.55 Model group 8.67±1.79* 0.59±0.19* 8.28±3.57* AVP group 5.01±1.59# 0.27±0.15# 23.56±4.51# *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs model group.

表 1 肺水含量和肺泡上皮通透性 Table 1 Lung water content and alveolar permeability in each group (Mean±SD,n=8)

与对照组比较，模型组α-ENaC 和α₁-Na⁺ ，K⁺- 显著降低（P<0.05）；AVP治疗后，α-ENaC 和α₁-Na⁺，K⁺-ATPase 的表达显著增加（P<0.05，图2，表2）。

图 2(Figure 2)

图 2 免疫组织化学法检测各组肺组织α-ENaC和α1-Na+,K+-ATPase的表达 Figure 2 Immunocytochemical detection of the expressions of α-ENaC and α1-Na+ , K+-ATPase in the lungs in each group. A: Control group; B: Model group; C: AVP group.

表 2(Table 2)

表 2 肺组织α-ENaC和α1- Na+，K+-ATPase的表达 Table 2 The expressions of α-ENaC and α1-Na+, K+-ATPase (Mean±SD, n=8) Group Immunohistochemistry Western blot α-ENaC α1- Na+, K+-ATPase α-ENaC α1- Na+, K+-ATPase Control 8.75±3.45 7.63±3.89 0.806±0.125 0.751±0.145 Model 2.88±2.42* 2.50±1.6 0* 0.349±0.141 * 0.338±0.186 * AVP 24.13±7.06# 21.25±6.48# 1.296±0.322 # 1.421±0.389 #

表 2 肺组织α-ENaC和α1- Na+，K+-ATPase的表达 Table 2 The expressions of α-ENaC and α1-Na+, K+-ATPase (Mean±SD, n=8)

与对照组比较，模型组α-ENaC 和α₁-Na⁺，K⁺- ATPase的表达显著降低（P<0.05）；AVP治疗后，α-ENaC 和α₁-Na⁺，K⁺-ATPase 的表达显著增加（P<0.05，图3，表2）。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blot 法检测肺组织α-ENaC和α1-Na+ , K+-ATPase的表达 Figure 3 Expressions of α-ENaC and α1-Na+, K+-ATPase in the lungs of the rats detected by Western blotting.

ALI/ARDS因肺泡腔内过多的水肿液聚集，含水量为正常的3~4倍，从而导致气体交换障碍，引起顽固性低氧血症。研究发现有效地清除肺泡腔内过多的水肿液，对维持气体交换和改善患者氧合至关重要，可明显降低ARDS患者的病死率^[11]。AVP作为一种较为特殊的血管活性激素，其特点是舒张肺血管和收缩全身血管。在脓毒血症导致的急性肺损伤患者中AVP 水平异常降低，并且给予外源性AVP治疗后能恢复血管活性，减轻肺组织炎症^[4-5]。新近研究发现AVP通过促进上皮钠通道转运的途径减轻了慢性心衰导致的肺水肿，发挥了关键作用^[12]。因此，本研究试图通过建立大鼠ALI 模型，探讨AVP对肺水肿液清除的作用机制。

LPS通过激活巨噬细胞产生炎性介质，在肺毛细血管处聚集了大量中性粒细胞，损伤肺泡-毛细血管屏障，导致肺泡及间质水肿，模拟了ALI/ARDS 的表现^[13]。本研究中，通过LPS 建立ALI 的动物模型发现，肺泡及间质水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构破坏、出血，透明膜形成，同时肺水含量和肺泡上皮通透性显著增加。经过AVP治疗后，肺水含量和肺泡上皮通透性显著降低，肺损伤程度也明显减轻。

ENaC 存在于肺泡上皮细胞顶膜，是完成肺泡腔内钠离子跨膜转运的限速步骤和提供AFC的源动力，同时与位于细胞底膜的Na⁺，K⁺-ATPase 共同完成钠水转运过程，在AFC中发挥十分重要的主导作用；其中，α-ENaC和α₁-Na⁺，K⁺- ATPase是发挥肺水肿液清除的关键通道蛋白^{[7, 14-15]}。本研究中，ALI模型组α-ENaC和α₁- Na⁺，K⁺-ATPase表达显著降低，AFC明显减少，肺水肿程度加重。同时经AVP治疗后，与模型组比较，AFC明显增加，肺水肿减轻，肺损伤程度也明显减轻，这与Ji 等^[3]研究结果一致。但本实验通过进一步探讨AVP 对α-ENaC 和α₁- Na⁺，K⁺-ATPase的作用发现，与模型组比较，AVP治疗后使AFC增加，促进钠水转运，从而减轻肺水肿的机制是通过上调α-ENaC和α₁-Na⁺，K⁺-ATPase 的表达实现的，从而有益于肺泡腔的气体交换，改善氧合，提示了AVP在ALI中促进肺水肿液清除的可能机制，这在国内外同类研究中报道甚少。

综上所述，AVP可以有效促进ALI时肺泡腔内过多的水肿液清除，从而减轻肺水含量，其作用途径可能是上调α-ENaC和α₁-Na⁺，K⁺-ATPase通道蛋白实现的，为临床治疗提供了理论依据。