蛋白质酪氨酸残基的磷酸化水平为一动态可逆过程。蛋白酪氨酸激酶（PTK）与蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）两大家族构成一个调控网络，精细地调节着酪氨酸残基的磷酸化程度。CD45是白细胞表面共同抗原，表达在除红细胞和血小板之外的所有血液细胞上，在免疫细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞表面均有表达。该分子为单链跨膜糖蛋白，是PTP家族成员，能特异地水解蛋白质底物上的酪氨酸磷酸酯键以脱去磷酸，与PTK 相互配合，调节蛋白质的功能，在免疫细胞的发育和活化中起着重要作用^[1]。CD45由4~6个外显子（常见的有A、B、C等）交替剪接而成，使其至少有9个变构体即亚型，如CD45RA、CD45RB、CD45RC、 CD45RO等。单个细胞可同时表达CD45的多个亚型，虽然这些亚型的胞外段结构不同，但胞浆段具有共同的酪氨酸磷酸酶活性结构域。研究表明，CD45在免疫细胞的信号转导调控中发挥了重要作用^[2]。早在10余年前，我国就开始了对制备放射性元素标记的CD45抗体的研究，为靶向治疗白血病奠定了基础^[3]。近年来，越来越多的研究集中在CD45对白血病、淋巴瘤和非造血系统肿瘤的鉴别、诊断和治疗^[4-7]。本研究克隆了人 CD45 基因PTPRC 的cDNA，构建重组真核表达载体 PcDNA3.1-3xflag-CD45，转染Hela 细胞并成功表达，建立了研究CD45功能的细胞模型，为进一步探索CD45的功能奠定了基础。

Hela 细胞、感受态细菌Top10、pMD-18T 载体和 PcDNA3.1-3xflag质粒均为本实验室保存。

高保真DNA多聚酶购于诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ以及T₄连接酶购于 Takara公司；质粒抽提试剂盒购于美基生物公司；转染试剂PEI购于Sigama公司；DMEM培养基购于Life公司；胎牛血清购于百旺生物公司；PE-CD45抗体为美天旎公司产品；抗标签蛋白单抗购于CST公司；HRP-抗鼠抗体购于杭州联科生物公司；碱性磷酸酶试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

Hela 细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，隔天用0.25%胰酶消化传代培养。

根据PTPRC基因序列设计1对基因扩增引物：上游引物5'-CCAAGCTTATGACCATGTATTTGTGGCTT AAAC-3'，下游引物5'-CCCTCGAGCTATGAA CCTT GATTTAAAGCTGGA-3'。上游引物中含有HindⅢ酶切位点，下游引物中含有XhoⅠ酶切位点，引物由Life公司合成。取健康人外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，提取总RNA，逆转录cDNA 后，用高保真DNA多聚酶扩增目的基因。PCR反应体系为50 μL，反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸2.5 min，35 个循环；最后72 ℃延伸5.5 min。回收PCR产物，连接到pMD-18T载体，获得 CD45 cDNA克隆pMD-18T-CD45。

采用PCR 技术，从质粒pMD-18T-CD45 扩增 CD45基因片段，分离PCR扩增产物，将其与真核表达质粒PcDNA3.1-3xflag分别用限制性内切酶HindⅢ和 XhoⅠ于37 ℃双酶切过夜，琼脂糖凝胶电泳回收，取酶切好的PCR产物片段和质粒DNA片段，用T₄连接酶于16 ℃连接8 h，将连接产物转化感受态Top10菌中，涂在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，次日挑取单克隆菌落，并在含有氨苄青霉素的LB 液体培养基摇菌扩增14~16 h。提取质粒 PcDNA3.1-3xflag-CD45，送华大基因公司测序。

取Hela细胞，加入6孔板内，于37 ℃、5% CO₂培养箱培养，次日待细胞贴壁融合生长达孔底面积的70%~80%时，进行细胞转染。DMEM稀释2 μg 质粒，加入2 μL 转染试剂PEI（2 mg/mL）混匀，放置15 min后，将其缓慢滴入已吸除培养液的6 孔板内，置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养48 h，鉴定CD45的表达及活性。

用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测CD45表达。细胞转染48 h后，以0.25%胰蛋白酶消化6孔板内细胞，以预冷的含1%新生牛血清PBS洗细胞3次，加入PE-CD45抗体，4 ℃反应30 min，用预冷的含1%新生牛血清PBS洗3次，上流式细胞仪分析CD45表达情况。

以免疫印迹（Western blot，WB）技术分析CD45表达。细胞转染24、48 和72 h 后，提取蛋白，行SDSPAGE分离，之后将凝胶上蛋白转移到PVDF膜上，用含5% BSA的TBST室温封闭2 h；加入用TBST 1∶1000稀释的抗标签抗体，4 ℃摇床震摇过夜；TBST洗膜3次后，加入HRP-抗鼠抗体，常温下反应1 h；TBST洗膜5次后，ECL曝光。

细胞转染后48 h，在细胞孔中加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，裂解30~40 min，用微量移液器吸出后测蛋白质浓度，严格遵循碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书操作，测定碱性磷酸酶活性，并按说明书公式计算每克蛋白的酶活性。

应用统计学分析软件SPSS16.0（SPSS,Inc. Chicago,IL,USA）进行数据学分析，本研究采用Student's t检验，P＜0.05认为具有统计学意义。应用软件Graphpad prism 5、FCS expression 3、Snap gene进行图像处理。

提取健康人外周血单个核细胞总RNA、逆转录 cDNA后，PCR扩增目的基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见相对分子质量约3900 bp特异条带（图 1），与目的条带CD45大小一致。将其连接到pMD-18T载体，获得CD45 cDNA克隆pMD-18T-CD45。

图 1(Figure 1)

图 1 RT-PCR 扩增人外周血单个核细胞中CD45 cDNA片段 Figure 1 CD45 cDNA fragment amplified from human peripheral mononuclear cells by RT-PCR. A: DNA maker; B: RT-PCR product; C: Blank control.

将从质粒pMD-18T-CD45扩增出来的PCR产物和空载体PcDNA3.1-3xflag双酶切、连接构建成重组表达载体。该载体约10 000 bp（图 2A带2），以HindⅢ和 XhoⅠ进行双酶切鉴定，可见重组质粒在约6000 bp和4000 bp有特异性条带（图 2A带3）。重组表达载体送华大基因测序，测序结果经Blast软件比对，与NCBI公布的序列一致（ID：5788），表明重组真核表达载体 PcDNA3.1-3xflag-CD45构建成功（图 2B）。

图 2(Figure 2)

图 2 CD45真核表达载体的鉴定 Figure 2 Identification of recombinant expression vector PcDNA3.1-3xflag-CD45. A: Identification of the recombinant expression vector PcDNA3.1-3xflag-CD45 by double restriction enzyme digestion (1: DNA maker; 2: Recombinant plasmid PcDNA3.1-3xflag-CD45; 3: Recombinant plasmid after double restriction enzyme digestion ); B: Recombinant plasmid profile.

转染重组表达载体PcDNA3.1-3xflag-CD45 以及空载体PcDNA3.1-3xflag到Hela细胞48 h后，以PE-抗 CD45抗体染色，FCM分析可见转染重组质粒的细胞比转染空载体者CD45表达明显增高（图 3）。转染24、48、72 h 后进行WB鉴定，在150 000（CD45）以及36 000（内对照GADPH）处可见特异条带，转染重组质粒的 Hela 细胞的CD45 条带明显深于转染空质粒者，表达在48 h 达高峰，但72 h 时仍有表达（图 4）。表明 PcDNA3.1-3xflag-CD45 能有效地转染Hela 细胞并表达CD45蛋白。

图 3(Figure 3)

图 3 流式细胞术检测转染质粒后CD45的表达 Figure 3 Analysis of CD45 expression in Hela cells transfected with plasmids by flow cytometry. A: Hela cells; B: Hela cells transfected with PcDNA3.1-3xflag; C: Hela cells transfected with PcDNA3.1-3xflag-CD45.

图 4(Figure 4)

图 4 免疫印迹检测转染质粒后Hela细胞CD45表达情况 Figure 4 Analysis of CD45 expression in Hela cells transfected with PcDNA3.1-3xflag or PcDNA3.1-3xflag-CD45 by Western blotting.

提取转染重组表达载体PcDNA3.1-3xflag-CD45或空载体PcDNA3.1-3xflag 48 h 后的Hela 细胞以及作为阳性对照的天然高表达CD45 的人T 细胞株 Jurkat 细胞的蛋白质，分析其磷酸酶活性，发现转染 PcDNA3.1-3xflag-CD45 的Hela 细胞的磷酸酶活性明显高于转染PcDNA3.1-3xflag 的细胞（P＜0.05，图 5），表明Hela 细胞中表达的重组CD45 蛋白具有生物学活性。

图 5(Figure 5)

图 5 Hela细胞表达重组CD45的磷酸酶活性 Figure 5 Phosphatase activity of recombinant CD45 protein expressed in Hela cells. **P＜0.05.

CD45 结构分为为胞浆区、跨膜区和膜外区3 部分。膜外区包括多态性区域、富含半胱氨酸区域以及保守区域。研究证实，CD45胞外段糖基化种类及程度可调节T细胞的分化、激活、调控和存活^[8-10]。文献报道^[11]，未成熟抗原提呈细胞通过其表面C型凝集素MGL与T细胞表面CD45 相互作用，负向调控T 细胞的功能； CD45胞浆区结构域具有酪氨酸磷酸酶活性，调控着底物蛋白质的磷酸化，从而调节细胞增殖、分化等。在白细胞中，某些Src 酪氨酸激酶家族为CD45 的底物，例如，T细胞内Lck和部分Fyn^[12]，B细胞内Lyn^[13]，巨噬细胞中的Hck和Lyn^[14]，以及树突状细胞中的Lyn、Hck和 Fyn^[15]等，其在TCR、BCR、NK细胞以及TLR的信号转导以及白细胞的粘附和迁移中发挥重要作用^[1]。因此，在某种意义上，CD45调控着所有白细胞的激活^[16]。近年来，不仅CD45的调控作用受到关注，其与疾病的关系越来越受到重视，CD45不同亚型的表达与自身免疫病及感染性疾病相关，表明CD45作为重要的免疫调节分子对疾病发生发展有着重要影响^[17-19]。同时，CD45抗体靶向造血细胞的免疫治疗受到了越来越多的关注^{[6, 20]}。

本研究中，我们将CD45基因从健康人单个核细胞中克隆出来，并将其与表达载体PcDNA3.1-3xflag 相连，构建成功重组表达载体PcDNA3.1-3xflag-CD45，转染到Hela细胞中，并能够正确翻译表达。为进一步考察其是否具有生物学活性，我们利用碱性磷酸酶能够分解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸，比色法检测酶活性的原理，发现Hela细胞表达的重组CD45蛋白具有一定的生物学活性。本实验成功地构建了CD45重组表达载体并在Hela细胞中有效表达，建立了有效的进一步研究CD45功能的细胞模型，为进一步揭示CD45的功能及其介导的细胞信号通路奠定了重要的物质基础。

随着对CD45 分子基因结构和功能的深入认识，CD45在淋巴细胞发育、活化中的作用及其机制等问题的阐明，CD45 必将在疾病的诊断、治疗和预后等方面发挥更大的作用。