据美国癌症协会最新报告显示：宫颈癌位列全球女性恶性肿瘤发病和致死数的第4位，且发病人群越来越趋于年轻化^[1-2]，是威胁女性健康的重要杀手。尽管目前拥有放疗、化疗及外科手术等多种有效的方法治疗宫颈癌，但其致死率仍然居高不下，最主要的原因就是肿瘤发生了侵袭转移^[3]。所以，寻找抗侵袭转移的新疗法已成为当前治疗宫颈癌的热点及难点。

Rb相关蛋白48（RbAp48）属WD-40蛋白家族，相对分子质量48 000，为一种Rb结合蛋白，参与染色质装配、重塑及核小体修饰等，调控细胞的分化、发育及干细胞的自我更新等，是维持细胞稳定和发育的关键因子^[4-5]。近年来研究发现RbAp48还参与了肿瘤的发生发展，与肿瘤的增殖、转移、复发和治疗抵抗有着密切的关系^[6]。

本课题组前期研究发现，人宫颈癌细胞的RbAp48蛋白表达明显高于其癌旁组织细胞，下调RbAp48的表达后宫颈癌细胞的生长受到明显的抑制，表明RbAp48可能是治疗宫颈癌的一个潜在靶点^[7]。至于下调 RbAp48表达对宫颈癌细胞的迁移和侵袭会产生怎样的作用尚未见报道，本研究对此课题进行了探讨。

人子宫颈癌细胞株MS751购自中科院上海细胞库。

Ctrl-siRNA、RbAp48-siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成；Lipofectamine RNA imax 购自 Invitrogen 公司；兔抗人RbAp48 单克隆抗体购自 Abcam 公司；兔抗人β-actin、Vimentin、N-cadherin、 E-cadherin、Snail、鼠抗人Twist、山羊抗兔IgG-二抗购自 CST公司；兔抗人MMP-2、TIMP-2 购自博士德公司； ECL 化学发光试剂盒购自Millipore公司。其余试剂均为国产分析纯。

人宫颈癌细胞MS751用含10%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的MEM培养基、5% CO₂、37 ℃培养，取对数生长期细胞用于实验。实验设Control组（Lipofectamine）、对照序列组（Ctrl-siRNA）和实验组（RbAp48-siRNA）。转染前24 h将细胞按4×10³/孔接种于96孔板，4×10⁵/孔接种于6孔板中，确保转染时细胞达到50%汇合度，按照lipofectamine RNA imax说明书分别进行转染。

以每孔4 × 10⁵ 细胞接种于6 孔板，对照组（CtrlsiRNA）和实验组（RbAp48-siRNA）转染后24 h，用200 μL枪头均匀划痕，PBS清洗3 遍，用含1%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的MEM培养基培养。在划痕后0、24 h对划痕进行拍照。实验重复3次。

按照BD公司使用说明书，将Transwell 小室置于24孔板中，下室加入800 μL含10%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的MEM培养基，上室加入300 μL含1%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的MEM培养基，含对数生长期的MS751细胞2×10⁵。培养48 h后，将小室取出并用 PBS清洗，对上室没有穿过的细胞用湿棉签轻轻擦掉，以100%结晶紫（无水甲醇配制）染色，在200倍显微镜下从小室的上、下、左、右、中共选取5个视野进行计数。实验重复3次。

按照BD公司使用说明书，将Transwell 小室置于24孔板中并在底部均匀涂上基质胶，下室加入800 μL含10%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的MEM培养基，上室加入300 μL含1%胎牛血清和0.11 g/L丙酮酸钠的 MEM培养基，含对数生长期的MS751 细胞2×10⁵个。培养48 h后，将小室取出并用PBS清洗，对上室没有穿过的细胞用湿棉签轻轻擦掉，以100%结晶紫（无水甲醇配制）染色，在200倍显微镜下从小室的上、下、左、右、中共选取5个视野进行计数。实验重复3次。

siRNA转染48 h后，分别提取各组细胞裂解10 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清，BCA法测总蛋白浓度；蛋白样品上样于12% SDS-PAGE电泳，半干法转印到PVDF膜；室温下用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封膜2 h，一抗4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育1 h，ECL化学显影。实验重复3次。

应用SPSS 20.0 和Excel软件进行分析，数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK法，以P＜0.01认为差异有统计学意义。

与Control组、Ctrl-siRNA阴性组相比，转染的3条 RbAp48-siRNA 001、002、003均显著降低RbAp48的表达，其中003序列下调效果较佳，被选做用于后续实验（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 RbAp48-siRNA对MS751细胞RbAp48表达的下调作用 Figure 1 Effect of RbAp48-siRNA on RbAp48 expression in MS751 cells. A: Expression of RbAp48 detected by Western blotting; B: Quantitative analysis of the results of Western blotting. **P＜0.01.

我们先前的研究发现人宫颈癌Hela（腺癌）、 MS751（鳞癌）在转染RbAp48-siRNA后48 h内未见明显细胞增殖抑制作用，尤其是MS751细胞株要在96 h后才有明显的细胞抑制作用^[7]，鉴于人宫颈癌大多为鳞癌（约>90%），所以本研究选用MS751细胞株观察下调 RbAp48后在细胞增殖尚无明显受抑制时对迁移侵袭的作用。细胞划痕实验显示，转染48 h后Control组及 Ctrl-siRNA 组划痕因细胞迁移而明显变窄，而 RbAp48-siRNA 组划痕仍保持较宽水平，表明细胞的迁移减慢（图 2A）。同样，Transwell 迁移实验显示，转染48 h 后，RbAp48-siRNA 组较对照组迁移的细胞数量明显减少（图 2B，C）。以上两个实验结果显示下调 RbAp48表达后，MS751细胞的迁移受到明显抑制。

图 2(Figure 2)

图 2 下调RbAp48的表达对MS751细胞迁移的影响 Figure 2 Effect of RbAp48 expression down-regulation on migration of MS751 cells. A: Wound healing assay; B: Transwell assay; C: Quantitative analysis of cell migration. **P＜0.01.

Transwell 侵袭实验显示，RbAp48-siRNA 转染组较Control组及Ctrl-siRNA对照组穿过基质胶的侵袭细胞数量明显减少（图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 下调RbAp48的表达对MS751细胞侵袭能力的影响 Figure 3 Effect of RbAp48 knockdown on invasion of MS751 cells. A: Transwell assay; B: Quantitative analysis of cell invasion. **P＜0.01.

与Control组、Ctrl-siRNA组相比，下调RbAp48表达后，可显著下调间充质细胞表型蛋白Vimentin、Ncadherin的表达，上调上皮型细胞表型蛋白E-cadherin的表达，显示下调RbAp48的表达可抑制MS751细胞的上皮-间充质样变（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 下调RbAp48 的表达对MS751 细胞Vimentin、 N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的影响 Figure 4 Effect of RbAp48 knockdown on the expressions of Vimentin,N-cadherin,and E-cadherin in MS751 cells. A: Western blotting; B: Quantitative analysis. **P＜0.01.

下调RbAp48表达后MS751细胞的基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达下降，与之相反，其活性抑制物金属蛋白酶抑制物2（TIMP-2）的表达却明显增加（图 5），表明下调RbAp48后MS751细胞的侵袭细胞外基质的能力会受到抑制。

图 5(Figure 5)

图 5 下调RbAp48 的表达对MS751 细胞MMP-2 和 TIMP-2蛋白表达的影响 Figure 5 Effect of RbAp48 knockdown on the expressions of MMP-2 and TIMP-2 in MS751 cells. A: Western blotting; B: Quantitative analysis. **P＜0.01.

Western blot 结果显示下调RbAp48 表达可使 MS751 细胞EMT上游调节蛋白Twist、Snail 表达下降（图 6），表明其抑制EMT 的作用与Twist、Snail 通路有关。

图 6(Figure 6)

图 6 下调RbAp48 的表达对MS751 细胞Twist、Snail 蛋白表达的影响 Figure 6 Effect of RbAp48 knockdown on the expressions of Twist and Snail in MS751 cells. A: Western blotting; B: Quantitative analysis. **P＜0.01.

肿瘤之所以难以根治，一个重要原因是其具有侵袭转移能力，这是当前抗肿瘤的一大难题^[8]。近年来研究证明，癌细胞发生的上皮-间充质样变（EMT）是肿瘤细胞迁移侵袭的一个关键因素^[9-10]。所谓EMT是指上皮细胞在特定因素的刺激下细胞转化成具有活动能力强、能够在细胞基质间自由移动的间充质样细胞的过程。这种改变不仅仅是细胞形态学的改变，更重要的是基因表型的改变，这主要包括有（1）上皮细胞表型的降低或缺失，如E-钙黏蛋白等；（2）间质细胞表型呈现过表达，如波形蛋白、N-钙黏蛋白、基质金属蛋白酶（MMP）等。细胞一旦发生EMT样变，则细胞骨架结构会发生变化，细胞形态由立方形变为纺锤形,细胞间的明显黏附性下降，而运动能力明显增强，从而使细胞更易于迁移游动，同时由于MMP（尤其是 MMP-2）的表达及活性增加，使细胞更具有侵袭性，易于发生转移。抑制肿瘤细胞EMT是当前抗肿瘤转移一个极具前途的靶向^[11-12]。

本研究发现下调RbAp48 表达后，MS751 细胞的上皮细胞表型蛋白E-cadherin 表达明显增加； E-cadherin是维持细胞上皮表型的重要分子,正常情况下细胞之间的E-cadherin通过胞外的免疫球蛋白结构域相互形成链接，并通过胞浆内的α、γ链接素（α、γ-catenin）与肌动蛋白骨架连接，从而形成稳定的细胞间接触，其表达量的变化是EMT最具标志性的指标之一^[13]。结合我们的结果，由于E-cadherin 的上调，显示下调RbAp48 后细胞间的粘附能力会有所增强，细胞的脱离会受到抑制。

EMT 另一个重要变化是Vimentin 表达升高。 Vimentin 是细胞骨架中间纤维的一种，广泛存在于间充质细胞及中胚层来源的细胞中。对于上皮源性细胞，Vimentin表达增多会使得细胞骨架结构发生变化，细胞形态由立方形变为纺锤形，细胞黏附性下降，细胞运动能力增强，从而使细胞更易于迁移游动。此外，N- cadherin 表达增多也是EMT 的重要特征；与 E-cadherin 相反，在间质型细胞中，N-cadherin 具有促进细胞运动和迁移的作用，其介导肿瘤细胞的迁移作用甚至超过E-cadherin所介导的细胞黏附作用。我们的结果发现经RbAp48-siRNA处理后间质细胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin 的表达均显著降低，说明下调 RbAp48 后抑制了宫颈癌MS751 细胞的间充质样变，使细胞的迁移能力受到抑制，从而能够抑制肿瘤细胞的转移。

如前所述，MMP表达的增多及活性增强是EMT的一个重要特征，其中尤以MMP-2 最具代表性，而 TIMP-2 是一个重要的金属蛋白酶抑制物，主要抑制 MMP-2 的活性，对其它多种MMP酶也具有抑制作用，同时还具有抑制新生血管生成的作用^[14]；所以 TIMP-2 表达的升高也是抑制宫颈癌细胞侵袭能力的一个重要因素。我们的实验观察到下调RbAp48表达后MMP-2 的表达受到一定程度的抑制，而TIMP-2 表达却得到提升，这一升一降，也从肿瘤细胞对细胞外基质侵蚀的环节产生抑制MS751侵袭转移作用。

EMT的发生受到诸如非编码RNA、蛋白信号通路等多种因素的调节，其中Twist、Snail是两个比较明确且关键的调节蛋白。Twist 属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，具有高度保守性，其基因5'端调节区域的启动子上游含有NF-κB、AP-2、SP-1和RB 的结合位点，并受这些因子的调节；Twist 能够抑制E-钙黏蛋白的表达，促进N-钙粘蛋白表达。Snail在正常上皮细胞中一般不表达，但在许多具有高转移特性的肿瘤细胞中常常呈现高表达，它能显著抑制E-钙黏蛋白及其它一些上皮细胞表型蛋白的表达，同时还会激活诸如波形蛋白、纤连蛋白及金属蛋白酶等间质细胞表型的表达^{[13, 15]}。本实验结果显示在下调RbAp48 表达后，Twist、Snail 蛋白的表达发生下调，表明下调RbAp48表达能够抑制EMT上游调节蛋白Twist、Snail，这对于 MS751 细胞EMT的发生具有负调控的作用，显然这与抗迁移侵袭有关，但至于更深层次的作用机制还有待进一步研究。

肿瘤细胞侵润转移是宫颈癌致死的关键，宫颈癌细胞通过发生EMT从而引发转移及耐药都已得到证实，针对EMT发生通路的靶向治疗也日益受到重视^[16]，本研究发现下调RbAp48的表达能有效抑制宫颈癌细胞株MS751的迁移和侵袭能力，这给根治宫颈癌提供了一个新思路。鉴于RbAp48在宫颈癌细胞中具有异常的高表达^[7]，其有望成为治疗宫颈癌的一个新靶点。