高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）是一类真核细胞细胞核内含量丰富的非组蛋白染色体结合蛋白。HMGB1参与核小体结构的构建和稳定，调节基因的转录，参与细胞的增殖^[1]，分泌于细胞外的HMGB1能够与细胞表面晚期糖基化终末产物受体（RAGE）结合，在调节细胞分化，增殖，炎症，迁移和生存等细胞生命活动中起重要作用^[2]。有报道在多种肿瘤组织中有HMGB1 的高表达，提示 HMGB1可能参与肿瘤的发生发展^[3-5]。

鼻咽癌的治疗以放射治疗为主^[6]，其治疗失败的主要原因为局部复发和远处转移^[7]。我们课题组前期针对HMGB1在鼻咽癌中的表达进行了研究^[8]，但是其在鼻咽癌细胞株C666-1中的作用尚未见文献报导。本文拟观察HMGB1对人鼻咽癌细胞株C666-1增殖的影响并探讨其可能的机制。

C666-1 人鼻咽癌细胞株来源于南方医科大学肿瘤研究所，胎牛血清购自BD公司；PRMI 1640培养基、 PBS、OPTI-MEN购自GIBCO公司；胰蛋白酶消化液购自吉诺公司；瞬时转染试剂Lipofectamine RNAiMAX购自Life Technologies 公司；RIPA蛋白裂解液购自罗氏公司；Western blot 电泳系统为Bio-Rad 公司产品； PVDF膜购自Bio-Rad 公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白Marker购自Thermo Fisher Scientific公司；脱脂奶粉购自广州威佳科技有限公司；牛血清白蛋白购自广州斯佳科技有限公司；Cyclin D1单克隆鼠抗体购自 Santa Cruz公司，β-actin兔单克隆抗体购自Bioword公司；羊抗兔、抗鼠二抗购自Abcam 公司；发光液购自 Bio-Rad公司；显影液、定影液购自天津市世纪奥博商贸有限公司；发光胶片购自Carestream公司；细胞周期检测试剂盒购自碧云天公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖-毒性检测试剂盒购自DOJINDO公司；EDU检测试剂盒购自吉凯公司；siHMGB1，siNC由上海吉玛公司合成；siHMGB1 RNA Oligo：正义链5'-3'CCCGUUAUGAAAGAGAAAUTT和反义链5'- 3'AUUUCUCUUUCAUAACGGGTT；siNC RNA Oligo：正义链5'-3'UUCUCCGAACGUGUCACGUTT和反义链5'-3'ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

人鼻咽癌细胞株C666-1采用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基培养，置于37 ℃，5% CO₂培养箱内培养，并于倒置显微镜下观察细胞生长状态，每1~2 d适时更换培养基，细胞长到80%左右用胰酶消化传代。取生长状态良好的细胞用于实验。

取生长状态良好的细胞，前1 d晚上铺6孔板，每个6孔板细胞密度约为30%~40%，确保细胞均匀铺于板底。第2天早上待细胞贴壁后不久即进行siRNA转染，每孔先将5 μLsiRNA和5 μL iMAX分别稀释于250 μL Opti-MEN中，置于冰盒孵育5 min，然后将二者混匀，静置20 min，加至残留有1.5 mL培养基的6孔板中。放入培养箱中培养用于后续的实验。

取生长状态良好的细胞，前1 d晚上铺6孔板，每个6孔板细胞密度约为70%~80%，确保细胞均匀铺于板底。第2 天早上待细胞贴壁后不久即进行质粒转染，将5 μg 质粒和10 μL P3000 稀释于125 μL Opti-MEN中，另将3.75 μL lipo-3000也稀释于125 μL Opti-MEN中，然后将二者混匀，室温静置5 min，加至残留有2.25 mL培养基的6孔板中。放入培养箱中培养，5 h后换液，用于后续的实验。

取瞬时转染12 h之后的细胞铺96孔板，细胞重悬成单细胞悬液，每孔1×10³个细胞，100 μL培基，每组3个复孔，由于孔板周边孔液体容易蒸发，故96孔板边上一圈的孔不铺细胞，只加PBS或者培基，培基用于调零。细胞置于37 ℃，5% CO₂培养箱内培养。12 h之后第1次检测，每孔加入10 μL的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响A值的读数）。将培养板在培养箱内孵育2 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。24 h之后第2次检测，以后每隔1 d的同时间点进行检测。

细胞瞬时转染之后72 h，待细胞长至80%~90%面积，弃培基，PBS洗2遍，胰酶消化，收集细胞沉淀，PBS 洗2 遍，弃PBS，用预冷的75%酒精固定细胞（把细胞缓慢加入酒精中，一边加，一边摇匀，防止产生絮状物），放入-20 ℃保存，至少固定8 h 以上。上机前准备：取固定好的细胞，离心弃上清，PBS洗2遍，加入300~400 μL PBS重悬，吹散成单细胞悬液，加入5 μL的RNase，放置15 min之后加入5 μL浓度为10 pmol/L的PI。避光染色5 min后，流式细胞仪上机检测。重复3次。

取瞬时转染24 h 之后的细胞铺96 孔板，细胞重悬成单细胞悬液，每孔5×10³个细胞，100 μL培基，每组3个复孔，细胞置于37 ℃，5% CO₂培养箱内培养。12 h 之后EDU 检测。细胞加入1000∶1 稀释的 EDU溶液培养2 h，弃培基，PBS洗2遍，每遍5 min，每孔加50 μL 固定液室温孵育30 min，弃固定液后每孔加50 μL 2 mg/mL甘氨酸，弃甘氨酸溶液，PBS清洗1遍，每孔100 μL渗透剂脱色摇床孵育10 min，PBS洗1遍。每孔加50 μLAPOLLO染色液，避光室温脱色摇床孵育30 min，再加入100 μL渗透剂，脱色摇床清洗2~3遍，每遍10 min，弃渗透剂，每孔100 μL甲醇清洗1~2次，PBS清洗1次，最后核染拍照。

取瞬时转染48 h之后的细胞，弃培养基，PBS洗3遍后吸干，加入配置好的RIPA细胞裂解液充分裂解（1×RIPA∶100×CK∶100×磷酸酶抑制剂=100∶1∶1）。将裂解液吸入标记好的EP管中，漩涡振荡器上每隔10 min震荡1次，每次15 s，共3次。12 000 g，4 ℃离心30 min，将上清转移至一新的EP管中（注意不要吸到沉淀物）。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度：取一块96孔板，根据样品的数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（200∶4），配制适量BCA工作液，摇床上充分混匀；各孔加入200 μL的BCA工作液，18 μL ddH₂O，2 μL蛋白样品（标准品按照说明书加样）；37 ℃放置30 min后，在562 nm波长下比色测定，以蛋白含量（μg）为纵坐标，吸光值（A）为横坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品总体积（2 μL），即为样品实际浓度（单位μg/μL）。按照蛋白样品的浓度计算出30 μg样品的上样体积，用裂解液将样品体积配齐，按照蛋白样品与5×SDS loading buffer体积比为4∶1制备上样缓冲液，95 ℃水浴锅煮10 min。配置10%的聚丙烯酰胺凝胶，80 V，30 min；100 V，90 min电泳。250 MA，120 min转膜。5%脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗10 min×3次，加入适当比例稀释的二抗，室温孵育60 min，TBST洗10 min×3，暗室内曝光，洗片。

所有计量数据均采用均数±标准差表示，采用 SPSS16.0 统计软件进行分析，样本均数的比较采用 Student's t检验进行统计，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

C666-1 细胞转染si-HMGB1 和阴性对照后，Western blot 验证其干扰效率，结果显示与对照组相比，HMGB1的表达水平下调（图 1A）。瞬时干扰C666-1细胞 HMGB1 基因，行CCK-8 和细胞周期实验检测干扰 HMGB1 后细胞增殖和周期的变化，结果显示干扰 HMGB1后，细胞增殖能力减弱（P＜0.001），处于G1期细胞比例增多（P＜0.001），S期细胞比例下降（P＜0.001，图 1B，C）。表明HMGB1能够促进鼻咽癌细胞株C666-1的增殖。

图 1(Figure 1)

图 1 干扰HMGB1后抑制鼻咽癌细胞株C666-1的增殖 Figure 1 Proliferation of C666-1 cells was inhibited after HMGB1 knockdown. A: Western blot analysis of the interference efficiency; B: CCK-8 analysis; C: Cell cycle analysis. ***P＜0.001 vs nc.

C666-1细胞转染带GFP的HMGB1质粒和空GFP质粒后，荧光显微镜观察其转染效率，结果显示质粒转染效率约60%~70%，并主要在核内表达（图 2A）。瞬时过表达HMGB1，行CCK-8 和EDU 实验检测过表达 HMGB1后细胞增殖的变化，结果显示过表达HMGB1后，细胞增殖能力增强（P＜0.001），处于S期细胞比例增多（P＜0.05，图 2B，C）。表明HMGB1 能够促进鼻咽癌细胞株C666-1的增殖。

图 2(Figure 2)

图 2 过表达HMGB1后促进鼻咽癌细胞株C666-1的增殖 Figure 2 Proliferation of C666-1 cells after trasnfection with the HMGB1 plasmid. A: Transfection efficiency observed by fluorescence microscopy; B: CCK-8 analysis; C: EDU analysis. *P＜0.05,***P＜0.001 vs nc.

在C666-1细胞中转染si-HMGB1和阴性对照，验证其干扰效率后，取瞬时干扰HMGB1的C666-1细胞行Western blot检测周期相关蛋白及相关通路蛋白表达的变化，结果显示下调HMGB1 后STAT3，P-STAT3，cyclin D1和CDK6的表达也下调（图 3），表明HMGB1可能通过STAT3通路促进cyclin D1和CDK6的表达。

图 3(Figure 3)

图 3 HMGB1促进鼻咽癌C666-1细胞STAT3,PSTAT3,cyclin D1和CDK6的表达 Figure 3 HMGB1 promotes the expressions of STAT3,P-STAT3,cyclin D1 and CDK6 in C666-1 cells analyzed by Western blotting.

HMGB1作为一种非组蛋白染色质结合蛋白，能够调节基因的转录，参与炎症，增殖等，在多种肿瘤中，如骨肉瘤，结肠癌，肝癌，胃癌，胶质瘤，喉癌中高表达，提示HMGB1 参与肿瘤的发生发展^[9-13]。此外，高表达 HMGB1的肿瘤细胞或者坏死的肿瘤细胞释放HMGB1到细胞外，激活的免疫细胞也可以主动分泌HMGB1^[14]，通过与RAGE结合，促进周围的肿瘤细胞增殖，从而使肿瘤不断长大^[15]。在结肠癌，肝癌，胸腺癌及食道癌中观察到HMGB1 和RAGE的高表达^[16-17]。提示细胞内 HMGB1 和分泌到细胞外的HMGB1 及其相关信号通路在肿瘤的发展中起着重要作用。分泌型HMGB1还可以刺激其他细胞产生相应的复杂的生物学效应，调节细胞分化，生长，成熟，调节炎症，神经生长，血管生成等。HMGB1 调节肿瘤的相关信号通路有JAK/STAT通路^[18]，肿瘤中STAT3的过度活化，可以抑制肿瘤细胞凋亡及促进细胞周期进程^[19-20]。HMGB1与RAGE结合后，可以激活ERK1/2，NF-kB，JNK，Rac 等通路，通过 ERK1/2-Cyclin D1，NF-kB/Cyclin D1 等促进肿瘤增殖^[21-22]。此外，HMGB1 也可以和Toll 样受体TLR2 和 TLR4结合，诱导相应细胞的活化，最终活化NF-kB，从而促进肿瘤增殖和转移^[23-25]。在很多文献中有报道，干扰肿瘤细胞HMGB1可以通过下调Cyclin D1介导肿瘤细胞G1/S期阻滞，从而抑制细胞增殖^[26-31]。

鼻咽癌是一种多基因遗传性疾病，其发病与遗传因素，EB病毒感染，环境因素，饮食文化等多种因素相关，好发于我国广东，广西，湖南，福建等地区。鼻咽癌由于部位隐蔽，不易于早期诊断，且易于复发和转移，尽管有关其发病机制的研究很多，对其分子机制也进行了深入探索，但是目前临床上整体治疗效果仍不理想。寻找早期诊断的分子标志，治疗靶标及预后监测因子，对鼻咽癌的治疗起着至关重要的作用。

我们在鼻咽癌细胞株C666-1中干扰HMGB1基因后，通过细胞周期和CCK-8实验发现，相对于对照组，细胞S期比例下降，增殖能力减弱，说明HMGB1能促进鼻咽癌细胞株C666-1 的增殖。western blot 检测发现下调HMGB1，能减弱cyclin D1和CDK6的表达，说明HMGB1可能通过促进cyclin D1和CDK6表达促进细胞由G1期进入S期，从而促进鼻咽癌细胞C666-1的增殖。这也提示HMGB1可能是鼻咽癌发生发展中一个重要的促癌因素，并有可能为鼻咽癌诊断和治疗提供新的方向。