支气管哮喘（简称哮喘）是一种由多种细胞和炎性因子引起的慢性气道炎症。气道的高反应性、慢性炎症和气道重塑是哮喘的基本特征^[1-2]。流行病学研究发现： 近年哮喘的发病率和死亡率有逐年增高的趋势，但目前其发病机制仍然不清^[3]。miRNAs是一组长度约为22 个核苷酸的非编码RNA，其可通过抑制靶基因的翻译或引起靶基因mRNA 降解来调控靶基因的表达^[4]。 最新的研究发现miRNAs 在哮喘的发病中起到重要作用^[5-6]。本课题组前期的研究发现哮喘小鼠肺组织中miR-20b的表达明显低于正常小鼠，但miR-20b对哮喘发病的进程有何影响还不清楚^[7]。本研究拟构建哮喘模型小鼠，观察鼻滴miR-20b模拟物后小鼠肺部病理变化的特点，以探讨miR-20b在哮喘发病中的可能作用。

鸡卵清白蛋白（OVA）、氢氧化铝（Inject Alum）分别是Sigma 公司和PIERCE公司产品，VEGF ELISA试剂盒购于武汉华美公司，miR-20b mimics 和其对照是由上海吉玛公司设计合成，序列如下：miR-20b mimicssense：CAA AGU GCU CAU AGU GCA GGU AG，antisense：ACC UGC ACU AUG AGC ACU UUG UU，miR-20b mimics controlsense：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT，antisense：ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT。YLS-8A多功能诱咳引喘仪是济南益延科技发展有限公司出品，ELISA酶标仪购于BioTek公司。

雌性BALB/c小鼠（2~3周龄）购于蚌埠医学院实验动物中心，随机分为4组：正常对照组（Control）、哮喘组（Asthma）、哮喘+ miR-20b 模拟物处理组（MiR-20b mimics）、哮喘+miR-20b 模拟物对照处理组（MiR-20b scramble），每组7只小鼠。除正常对照组外，其余3组于实验第0 天、7 天和14 天小鼠腹腔内注射200 μL致敏液（含OVA 50 μg，氢氧化铝2 mg），从实验第21 天起，将小鼠置于雾化吸入箱中，每天用5% OVA溶液雾化吸入激发（图 1），每次雾化30 min，连续雾化4 周。 MiR-20b mimics组小鼠于实验第20天起，经鼻滴20 μg miR-20b mimics 40 μL/次，1 次/3 d，共进行10 次。 MiR-20b scramble 组则以MiR-20b scramble 代替miR-20b mimics进行（图 2）。

图 1(Figure 1)

图 1 本研究采用的雾化装置 Figure 1 Atomization device used in this experiment.

图 2(Figure 2)

图 2 本研究采用的流程图 Figure 2 Experimental model procedure in this study.

实验第49 天，各组小鼠被拉颈处死，进行气管插管，留置12 号针头并固定，用PBS进行支气管肺泡灌洗，0.8 mL/次，连续6次。收集BALF离心，上清低温保存待用，沉淀红细胞裂解后进行细胞计数及涂片、瑞氏染色分类计数。

收集各组小鼠BALF中上清，采用ELISA方法检测VEGF的含量，详细的方法见试剂盒说明书。

收集各组小鼠左肺组织，4%多聚甲醛液中固定1 周，常规酒精脱水，然后二甲苯透明及石蜡包埋，制备5 μm厚的石蜡切片，经脱蜡、浸泡等常规处理后苏木精- 伊红染色，然后二甲苯透明、中性树脂封片，光镜下观察拍照。

数据采用均数±标准差表示，统计软件是SPSS 16.0，组间比较使用方差分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

哮喘组小鼠BALF中细胞总数及淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的分类计数均较正常对照组明显升高（P<0.01），哮喘小鼠经miR-20b mimics处理后，细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的分类计数均明显降低（P<0.01），但淋巴细胞的计数不受影响。哮喘+ miR-20b scramble处理组与哮喘组相比，上述细胞数无明显变化（图 3，4）。

图 3(Figure 3)

图 3 miR-20b对BALF中细胞总数的影响 Figure 3 Effect of miR-20b on the total numbers of cells in BALF.

图 4(Figure 4)

图 4 miR-20b对BALF中白细胞分类计数的影响 Figure 4 Effect of miR-20b on the leukocyte classification counts in BALF.

肉眼观察：正常小鼠肺组织均匀红润，而哮喘小鼠肺体积明显增大，肺表面多个区域肿胀泛白，呈地图状。哮喘+miR-20b mimics处理组小鼠肺体积较哮喘组有所减少，部分泛白区域趋于红润。哮喘+miR-20b scramble组小鼠肺大体与哮喘组类似（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 miR-20b对肺大体形态的影响 Figure 5 Effect of miR-20b on the morphology of the lung.

肺组织HE染色后镜下观察：正常对照组小鼠支气管及肺泡壁结构完整、规则，无明显增生、增厚，支气管管腔光滑，官腔中未见明显渗出物。哮喘组小鼠气道粘膜水肿增厚，褶皱增加，平滑肌增生，管腔狭窄，管腔中有大量粘液分泌，支气管周围有明显的炎性细胞浸润。 哮喘小鼠经miR-20b mimics处理后，黏膜增厚减轻，管腔规则，无明显平滑肌增生，仅有少量的粘液分泌，支气管周围炎性细胞的浸润也有所减轻。但哮喘小鼠经miR-20b scramble处理后肺组织形态改变不明显（图 6）。

图 6(Figure 6)

图 6 miR-20b对肺组织病理学变化的影响 Figure 6 Effectof miR-20b on pathological changes of lung tissue. Control: normal control group; Asthma: asthma group; MiR-20b mimics: asthma+miR-20b analogues treatment group; MiR-20b scramble: asthma+miR-20b scramble treatment group.

VEGF在慢性哮喘的发病中起到重要作用，因此我们对miR-20b 是否影响BALF中VEGF的表达进行了观察。结果如图 7：哮喘组小鼠BALF 中VEGF 浓度28.55±3.42 pg/mL较正常组16.13±2.61 pg/mL明显升高（P<0.01）；哮喘小鼠经miR-20b mimics 处理后， BALF 中VEGF 含量降为18.19 ± 3.67 pg/mL，但MiR-20b scramble的处理对其无明显影响（图 7）。

图 7(Figure 7)

图 7 miR-20b对BALF中VEGF浓度的影响 Figure 7 Effectof miR-20b on the concentration of VEGF in BALF. Control: normal control group; Asthma: asthma group; MiR-20b mimics: asthma + miR-20b analogues treatment group；MiR-20b scramble: asthma + miR-20b scramble treatment group. *P<0.01 υs control group; #P<0.01υs asthma group.

哮喘是呼吸系统最常见的疾病之一，流行病学调查研究表明，目前全球约有3 亿哮喘患者，平均每年因哮喘死亡的病例多达250 000 人，并且哮喘的发病率、死亡率有逐年增高的趋势，哮喘已成为世界性的社会公共卫生问题^[8]。

哮喘的实质是气道的一种慢性炎症，多种因素牵涉其中，目前确切的发病机制仍然不清^[9]。miRNAs是一种约22个核苷酸长度的非编码RNA，其主要通过阻止翻译或mRNA的转录从而控制细胞的生长发育、增殖、 凋亡等生物学过程^[10]。近期有多个课题组报道miRNAs对哮喘的发病产生了重要影响。Simpson等^[11] 的研究表明：哮喘病人气道浸润T细胞miR-19的表达升高，miR-19促进Th2型细胞因子的产生并增加了气道炎症反应，miR-17~92基因簇缺陷的T细胞，Th2极化反应明显降低，该研究指出哮喘中miR-19的上调可能是气道Th2 型细胞因子产生增加的标志和原因。 Haj-Salem^[12]则证明重度哮喘病人支气管上皮细胞miR-19a 的表达上调，miR-19a 通过靶向TGF-β受体2 而增加支气管上皮细胞的增殖，从而在气道重塑中起到重要作用。Martinez-Nunez课题组^[13]发现，哮喘病人支气管上皮细胞miR-18a、miR-27a、miR-128、miR-155的表达下调，并且有趣的是只有当所有这些成分的功能同时被抑制时，才能控制IL-6、IL-8等炎性因子的表达上调，而单个miRNA的调节并无此效应。我们前期的研究发现：与正常小鼠相比，哮喘小鼠肺泡巨噬细胞miR-20b 的表达明显下调^[7]。本研究则进一步证明miR-20b 可以抑制哮喘小鼠气道的炎症。miR-20b 属于miR-106a-363 基因簇成员，位于X染色体^[14]。目前关于miR-20b的研究相对较少，Lei等^[15]人的研究表明， 低氧状态下，miR-20b 的升高降低了H22 肝癌细胞VEGF与HIF-1α蛋白的表达，miR-20b可以负性调节这种细胞VEGF 的表达。此后，Cascio 等^[16]又证明在MCF-7 乳腺癌细胞中miR-20b 可通过靶向HIF-1α与STAT-3降低VEGF的表达。VEGF是最重要的血管生成诱导因子，涉及多种生理性（胚胎发育、骨骼生长、生殖功能）和病理性（肿瘤、缺血、炎症）的血管发生过程^[17-18]。 VEGF一方面可引起血管通透性增加，导致炎性细胞和介质渗出到气道血管外间隙内,产生气道炎症；另一方面它能刺激血管内皮细胞增殖，促进气道新生血管生成，在气道重塑中起到重要作用，因此VEGF对于哮喘的发病具有重要的病理生理学意义^[19]。我们前期的研究证明哮喘小鼠肺泡巨噬细胞VEGF的表达上调，与miR-20b的表达正好相反，本研究进一步证明miR-20b 的作用使BALF中VEGF的含量降低。miRNAs的作用主要是通过其5’端7-8个碱基的“种子区”（seed region） 与靶基因3’-UTR互补结合来抑制靶基因的表达。根据miRanda 算法（http://www.microrna.org/microrna/）， VEGF的3’-UTR区含有miR-20b 的作用靶点。因此miR-20b可能是通过直接靶向VEGF而抑制哮喘小鼠气道炎症，当然，要明确此问题，仍有待进一步研究。