Bcl-6蛋白和bcl-2蛋白同属于B淋巴细胞瘤蛋白家族，研究证明该家族基因主要参与细胞的凋亡过程，其中包括促进细胞凋亡的一组基因和抑制细胞凋亡的一组基因，bcl-6与bcl-2基因功能相似，在细胞的生理过程中发挥抑制凋亡的作用^[2]；不仅如此，bcl-6是一种转录抑制因子^[3]，其通过调控多种靶基因表达参与调控细胞的活化^[4]、分化^[5]和增殖^[6]等过程；同时还参与细胞周期调控^[7]及DNA损伤修复^[8]。

近期研究发现，bcl-6基因除了与多种淋巴瘤密切相关外还与多种实体肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌^[9-10]、多形性胶质母细胞瘤^[11]、结肠癌^[12]和胆囊癌^[13]等。由于bcl-6在肿瘤发生发展中的作用被认识，其调控机制也成为研究中的热点。研究发现bcl-6表达不但受到转录因子^[14]和细胞因子的调控^[15]，同时也受到miRNA的转录后调控，例如：miRNA-127^[6]。但是现在发现的靶向bcl-6的miRNA还比较少，其调控网络有待于进一步研究充实。在miRNA 研究中目的基因的3'UTR区报告质粒和表达载体必不可少。本实验中，我们通过基因克隆技术构建bcl-6基因的野生型3'UTR区报告质粒和bcl-6基因的表达载体，为下一步筛选新的直接靶向bcl-6的miRNA奠定实验基础。

人胚肾293T 细胞、人肝细胞癌HepG2 细胞、pcDNA3.0-miR-127 质粒、空载体pcDNA3.0-FLAG和pcDNA3.0-Luc由解放军总医院肿瘤内科保存，大肠杆菌感受态DH5α购自康为世纪生物科技有限公司。Prime STAR HS DNA Polymerase、限制性核酸内切酶（EcoRⅠ、XbaⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ）、T₄连接酶购自TaKaRa公司；真核细胞质粒小量提取试剂盒、荧光素酶报告基因底物为Promega公司产品；PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒采购自北京天根生物科技有限公司；转染试剂VigoFect 购自威格拉斯生物技术有限公司；兔抗人bcl-6 单克隆抗体、兔抗人Cyclin D1 单克隆抗体购自Abcam公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶偶联的抗FLAG 抗体购自Sigma 公司；miR-127 inhibitor 为Qiagen公司产品。测序由北京博迈德技术有限公司完成。引物合成来自北京赛百盛生物技术有限公司。其余化学试剂为国产分析纯产品。

查询TARGET（www.targetscan.org）和PUBMED（www.pubmed.com）分别获得bcl-6 3'UTR 区序列和bcl-6 基因CDS区序列，设计并合成引物如下：bcl-6 3'UTR区：（上游）5'-CGGAATTCAGCATGGAGTGTTGATGCTTTCGTCTCCA-3'；（下游）5'-GCTCTAGACCAGTTTGACTTTTCAACATTTTATTCTTATA-3'。bcl-6 表达载体：（上游）5'-GGGGTACCATGGCCTCGCCGGCTGACAGCTGTATC-3'；（下游）5'-CCGCTCGAGTCAGCAGGCTTTGGGGAGCTCCGGAG-3'，突变体bcl-63'UTR 区：（上游）：5'-GACTCGAAGTGTCTGCCTGCAGATACAAAATCGAGCCT-3'；（下游）：5'-AGGCTCGATTTTGTATCTGCAGGCAGACACTTCGAGTC-3'，下划线为酶切位点，加粗斜体为bcl-6 3'UTR突变位点（miR-127结合位点）。分别以乳腺基因组和乳腺文库为模板，应用PCR扩增上述两种目的片段，具体条件为：95 ℃ 5 min 预解螺旋，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃3 min，共32个循环，72 ℃ 7 min 延伸完毕。所得产物行琼脂糖凝胶电泳，切下带有目的片段的琼脂糖，应用胶回收试剂盒回收PCR产物后进行双酶切，同时酶切载体，将酶切好的目的片段与载体16 ℃链接6 h，转化感受态DH5α，37 ℃培养14 h形成菌落，挑取一定数量菌落行菌液PCR鉴定，阳性者提取质粒酶切鉴定，酶切后阳性克隆测序鉴定。

细胞培养应用含有10%胎牛血清的DMEM培养基。报告基因活性检测试验：将细胞以1×10⁶/mL浓度接种于24孔板中，转染前1 h换新鲜培养基，将0.5 μL脂质体Vigofect与25 μL生理盐水混合，同时将质粒按照pcDNA3.0-Luc 或Wild-typebcl-6-3'UTR 或Mutated bcl-6-3'UTR 报告基因质粒0.25 μg，miR-127 1 μg，pRL-TK 0.1 μg 的比例混合于25 μL生理盐水中，室温放置5 min后将两者混合后室温放置15 min，加入24 孔板中，每组设3 个副孔。37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h 后收细胞进行荧光素酶活性检测。细胞周期试验：采用2次转染方法进行回复实验，具体转染分组如下：

第1组：miR-control+pcDNA3.0-FLAG；

第2组：miR-127+pcDNA3.0-FLAG；

第3组：miR-127+pcDNA3.0-FLAG-bcl-6。

将HepG2细胞以5×10⁶/mL密度接种于6 cm皿中，24 h后进行转染，转染前1 h换新鲜培养基，将miR-1275 μg 混合于200 μL 生理盐水中，同时将4 μL 脂质体Vigofect混合于200 μL生理盐水中，室温放置5 min后将两者混合后室温再放置15 min，加入6 cm皿。培养24 h 后进行回复实验转染，转染方法同前，转染5 μgpcDNA3.0-FLAG-bcl-6 于miR-127 过表达细胞，继续培养24 h后收细胞一半进行流式细胞周期检测，一般行Western blot 检测相关蛋白表达。MiR-127敲低实验转染方法参考过表达转染方法。

收集细胞，1500 r/min 离心10 min，吸弃上清，用含有3%胎牛血清的PBS洗1次，用含上述PBS 30%，乙醇70%混合液-20 ℃固定过夜。取-20 ℃固定的细胞3000 r/min离心1 min，弃上清，再用含有3%胎牛血清的PBS洗细胞两次，弃上清，加入含有RNaseA 浓度为1 mg/mL 的PBS 0.2 mL，37 ℃水浴30min，再加入0.3mLPI置暗处染色，20min后上机检测。

转染后48 h收细胞，加入适量RIPA裂解液冰浴裂解细胞30 min，混合等量的SDS缓冲液，煮沸15 min后进行SDS-PAGE检测。将蛋白半干电转于纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入兔抗人bcl-6抗体（1∶500）、兔抗人Cyclin D1抗体（1∶250）和兔抗人GAPDH抗体（1∶1000），室温平衡摇床轻摇1 h；TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG（1∶2000），室温轻摇1 h；TBST洗膜3次，化学发光法显色后压片显影。

转染后48 h 弃24孔板中的培养基，PBS洗1次，加入100 μL 报告基因裂解液（RLB），室温轻摇1 h，收取细胞裂解产物与EP管中，震荡10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min。取20 μL裂解液上清与等量的荧光素酶报告基因底物混合，应用荧光测定仪检测荧光素酶活性。

将2次转染后的HepG2细胞以2×10⁴/mL细胞数接种于96孔板中，每个孔加入100 μL细胞悬液并设置3个复孔，常规培养。分别于贴壁后、24、48、72、96 h，取一块96孔板，在接种孔中加入10 μL CCK-8 试剂；37 ℃、5% CO₂常规培养1 h，测定A₄₅₀值；以测量时间点为横坐标，A值为纵坐标绘制生长曲线。

应用基因克隆技术以乳腺基因组为模板，PCR扩增bcl-6 3'UTR区和CDS编码区序列，琼脂糖电泳分别观察到大小在1100 bp和2100 bp左右的目的片段（图 1A），两目的片段回收后分别用EcoRⅠ和XbaⅠ、KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后插入各自载体，转化后挑取菌落行菌液PCR，阳性克隆提质粒酶切鉴定，结果显示均可切出大小相符的目的片段（图 1B），测序后显示插入片段为目的片段且构象正确（结果略）。

图 1(Figure 1)

图 1 Bcl-6 3'UTR区报告质粒及其表达载体重组质粒的构建 Figure 1 Construction of bcl-6 3'UTR region reporter plasmid and expression vector. M:DNA marker（BM 2000）; 1: bcl-6 CDS region; 2: Wild-type bcl-6 3'UTR region. A:PCR products; B: Enzyme digestion.

应用重组PCR 技术，以构建好的野生型bcl-63'UTR质粒为模板，以野生型上游引物和突变体下游引物、野生型下游引物和突变体上游引物PCR分别扩增含有突变位点的上下游片段，纯化后以这两个片段为模板用野生型引物PCR扩增含有突变位点的突变体bcl-63'UTR区，琼脂糖电泳回收可观察到大小在1100 bp左右的目的片段（图 2A），目的片段回收后用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后插入各自载体，转化后挑取菌落行菌液PCR，阳性克隆提质粒酶切鉴定（图 2B），测序显示突变成功（结果略）。

图 2(Figure 2)

图 2 突变体bcl-6 3'UTR区报告质粒的构建 Figure 2 Construction of mutated bcl-6 3'UTR region reporter plasmid. M: DNA marker（BM 2000）; 1: Mutated bcl-6 3'UTR region. A: PCR product; B: Enzyme digestion.

分别将pcDNA3.0-Luc、野生型bcl-6 3'UTR 和突变体bcl-6 3'UTR 质粒转染入HEK293T 细胞，37 ℃5% CO₂ 全湿度培养48 h。收取细胞，行荧光素酶报告基因活性检测，结果显示三者的相对荧光素酶活性值分别为1.11±0.108、1.20±0.165、1.15±0.095，具有相似的荧光素酶活性。将pcDNA3.0-FLAG和pcDNA3.0-FLAGbcl-6转染入HEK293T细胞，37 ℃ 5% CO₂ 全湿度培养24 h，收细胞行Western blot检测，结果显示：应用FLAG抗体在80 000 左右的位置可以看到明显条带，符合bcl-6的大小（图 3A）。说明质粒表达正常。

图 3(Figure 3)

图 3 重组质粒表达的鉴定 Figure 3 Expression of bcl-6 protein in HEK293T cellstransfected with the recombinant plasmids detected byWestern blotting.

将miR-127 表达载体分别和野生型（WT）bcl-63'UTR区或突变体（Mut）bcl-6 3'UTR区报告基因质粒共转人胚肾HEK293T细胞及肝细胞癌HepG2细胞，48 h后收细胞进行荧光素酶活性测定，结果显示：在两种细胞中miR-127均可以明显降低bcl-6 3'UTR区报告基因的活性水平超过50%，对空载体pcNDA3.0-Luc及突变体bcl-6 3'UTR 区报告基因的活性并没有明显的降低（图 4）。说明bcl-6是miR-127的直接靶基因，这与文献报道相一致。

图 4(Figure 4)

图 4 miR-127对bcl-6 3'UTR区报告基因活性的影响 Figure 4 Effect of miR-127 on bcl-6 3 'UTR region reporter plasmid.

用两次转染的方法分别将miR-127和bcl-6转染入HepG2细胞相应分组，bcl-6转染后24 h收细胞，一部分固定进行流式细胞周期检测，另一部分进行Westernblot检测相关蛋白表达水平，结果显示：相比对照组转染miR-127后可以引起细胞的G₀/G₁期阻滞，同时转染miR-127和bcl-6后miR-127引起G₀/G₁期阻滞消失（图 5A）。同时Western blot检测发现miR-127可以明显抑制bcl-6表达及Cyclin D1的表达，回复bcl-6蛋白表达后，Cyclin D1的蛋白水平也得到了恢复（图 5C）。相反我们发现敲低miR-127 可以抑制G₀/G₁其阻滞且升高bcl-6 表达及Cyclin D1 的表达（图 5B，5D）。说明：miR-127 可以降低bcl-6 的表达进而抑制Cyclin D1 的蛋白水平，从而表现出细胞周期G₀/G₁期阻滞；bcl-6表达载体可以回复miR-127 引起的bcl-6 蛋白水平的降低，具有生物学活性。

图 5(Figure 5)

图 5 miR-127对细胞周期的影响及bcl-6对miR-127的拮抗作用 Figure 5 Bcl-6 antagonized the effect of miR-127 on cell cycle in HepG2 cells.A,B: Flow cytometry; C,D: Expression of bcl-6 and Cyclin D1 detectedby Western blotting. A,C: Overexpression of miR-127 and the effect ofbcl-6; C,D: Knockdown of miR-127 and the effect of bcl-6.

采用二次转染的方式将HepG2 分成3 组：Emptyvector+pcDNA3.0-FLAG、miR-127+pcDNA3.0-FLAG、miR-127+bcl-6。将细胞分别接种于96孔板中，每组设置3个副孔，分别在贴壁后、24、48、72、96 h取一块96孔板，在每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃ 5% CO₂全湿度培养1 h后测定A₄₅₀值并绘制生长曲线。结果显示：miR-127可以明显抑制HepG2细胞生长，回复bcl-6表达水平后细胞的生长速度也得到回复。miR-127过表达组与其他两组之间具有统计学意义（P＜0.05，图 6A）。抑制miR-127 表达则促进细胞的生长（图 6B）。这一结果提示：bcl-6 可以拮抗miR-127 引起的抑制细胞生长的作用。

图 6(Figure 6)

图 6 miR-127对细胞生长的影响 Figure 6 Growth curves of HepG2 cells with miR-127 overexpression (A) and knockdown (B) andtransfected with bcl-6 vectors.

bcl-6是Baron等^[16]研究B细胞非霍奇金淋巴瘤基因组重组的时候发现和命名的。bcl-6主要表达于生发中心的B细胞和CD4^＋的T细胞，与生发中心的形成及维持密切相关，研究发现，bcl-6可以抑制T细胞向Th2细胞分化^[17]，通过与转录因子STAT3相互作用抑制B细胞分化必须膜分子的表达，进而达到抑制B细胞分化的目的^[18]，同时bcl-6还通过抑制P53基因的促凋亡作用进一步达到维持生发中心的作用^[19]。由于bcl-6原癌基因的特性，其表达受到严格的调控，当出现染色体异位及点突变都会引起bcl-6 启动子的异常激活^[20]，从而使bcl-6表达异常增加，引起机体产生癌变。不仅仅在淋巴瘤中检测出bcl-6的异常表达，其还参与多种实体性肿瘤中的发生发展。因此bcl-6成为了药物研究的新靶点，bcl-6表达的调控机制和调控分子被渐渐发现。

miRNA已经成为生物体不可或缺的调控手段，与多种疾病的发生有重要的关系。Saito等^[21]首先发现两种染色质修饰药物可以引起癌症细胞miR-127表达的升高进而引起bcl-6的降低，后期的研究也进一步证实，bcl-6 为miR-127 的直接靶基因^{[6, 22]}。Wu 等^[23]发现miR-339-5p以bcl-6为靶基因，进而抑制乳腺癌细胞的生长和转移。这仅仅是以bcl-6为靶基因的miRNA研究的开始。

在miRNA研究中，目的基因3'UTR区报告质粒的构建及荧光素酶活性检测是判定miRNA作用靶基因的直接证据，我们在实验中成功构建了bcl-6 基因的3'UTR区报告质粒，与miR-127共转发现活性明显受到抑制，这与前期研究报道相一致，为后期进一步筛选以bcl-6为直接靶点的miRNA奠定了实验基础。回复实验的目的是为了在敲低实验中防止出现脱靶效应，在抑制基因表达实验中被用来证实该siRNA的特异性。由于miRNA与siRNA同样是以降低基因表达而发挥其功能，所以回复实验是不可或缺的。我们构建了bcl-6CDS序列表达载体，研究发现其可以逆转miR-127引起的细胞周期的改变及细胞生长的改变，这说明bcl-6质粒具有生物学活性。为后期检测筛选的miRNA功能试验奠定良好的实验基础