脑血管疾病（cerebrovascular disease,CVD）是神经系统常见病及多发病，严重威胁人民的身体健康^[1]，缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease,ICVD）占CVD的70%左右。脑缺血梗死后血液再通会出现脑缺血-再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusioninjury,CIRI），其机制十分复杂。Apelin是一种小分子内源性神经肽，是血管紧张素受体样蛋白J受体的天然配体，不仅参与了神经系统的生理功能调节，也与其发生、发展密切相关，具有神经保护作用^[2-4]。Apelin可被肽酶分解成多种相对分子量不同的成熟活性肽，以Apelin-13 的生物活性最强。本研究拟观察Apelin-13对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的作用，探讨其作用机制，为CIRI的防治提供新的方法和策略。

Apelin-13为美国Sigma公司产品，MDA测试盒和SOD 测试盒购自武汉博士德生物工程公司；兔抗ERK1/2多克隆抗体和兔抗p-ERK1/2多克隆抗体为美国Cell Signaling Biotechnology 公司产品。Apelin-13溶解于0.9%的生理盐水中，配置成不同浓度的溶液（单位μg/kg）。

选取8 周龄的健康S-D 雄性大鼠100 只，体质量250~300 g（中南大学实验动物学部提供）。随机分为5 组：假手术组（只分离血管20只）、缺血再灌注模型组（20只）、Apelin-13干预组（10 μg/kg为干预A组、50 μg/kg为B组、100 μg/kg为C组，每组20只），再灌注前15 min侧脑室注射Apelin-13溶液5 μL。假手术组和模型组注射相同剂量的生理盐水。每组随机取5只大鼠，断头处死取出整个脑组织，进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，观察梗死的体积；5只大鼠取全脑组织，称取大脑湿质量，然后108 ℃烘烤72 h后，再称干质量；5只大鼠进行TUNEL染色；余下5只大鼠在断头处死后取出全脑组织后，取缺血半暗带脑组织，用于MDA和SOD以及Western blotting检测。

所有实验S-D大鼠在实验室恒温、恒湿动物房中适应环境一周，12 h昼夜交替，自由饮食，避免不良刺激。术前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后固定在脑立体定位仪上，矢状缝和冠状缝愈合处向后3~4 mm，中线旁开1.5 mm 处，深度为3.5 mm，钻孔埋入插管套管，骨蜡封闭固定。每次注药3 min并留针l min^[5]。埋管后，参照zea-Longa线栓法^[6]，并略加改进制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型。颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内、外动脉，在动脉分叉处结扎颈外动脉，颈总动脉剪一小口，插入头端呈圆钝形的尼龙鱼线（直径0.28 mm），插入长度约18 mm，在大脑中动脉起始端堵塞动脉。将颈总动脉和尼龙鱼线一起结扎，缝合皮肤。在阻断血流2 h后，通过拔出尼龙鱼线实现再灌注72 h。假手术组只分离血管，不结扎动脉，不插入尼龙鱼线。大鼠苏醒后左侧肢体瘫痪，站立不稳，左上肢屈曲、行走时向左侧转圈的大鼠为造模成功，用于后续实验^[7]。

观察肢体瘫痪，站立，肢体屈曲，行走情况。采用Longa^[6]的5级4分法进行神经功能评分：无明显神经功能缺损记为0分；左前肢伸展障碍记为1分；行走时向左侧旋转打圈记为2分；行走时向左侧倾倒记为3分；不能自发行走，意识丧失，昏迷记为4 分；动物死亡记为5分。评分为0分、4分和5分的大鼠均被剔除，剔除的大鼠在后续实验中得到补充^[8]。

大鼠脑缺血2 h再灌注72 h后，断头取出全脑，去掉低位脑干、嗅球和小脑，用电子称称取大脑湿质量，然后108 ℃烘烤72 h后，再称取大脑的干质量。脑组织含水量的计算公式为：（湿质量－干质量）/湿质量×100%。大鼠断头处死后完整取出脑组织，将大脑均匀切成5片冠状切片。脑片浸入2% TTC溶液，37 ℃恒温水浴中孵育15 min染色，染色后取出于4%多聚甲醛中固定24 h后，数码相机摄像，红色区域为正常脑组织，苍白色区域为梗死区，相机微距拍摄，Image pro plus 5.1图像分析软件分析并计算脑梗死体积。TUNEL染色时先行缺血再灌注后，麻醉后剪开胸腔，暴露心脏，从左心室快速灌注生理盐水100 mL，然后以4%多聚甲醛200 mL左右灌注固定，石蜡包埋，切片，片厚约为5 μm，相邻切片分别予以TUNEL 染色，中性树胶封片，观察脑组织凋亡情况。

大鼠断头取出脑组织，然后取缺血周边半暗带脑组织，低温粉碎、高速离心提取脑组织匀浆上清液，按照试剂盒说明书进行操作，采用分光光度法检测脑组织匀浆上清液中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。提取脑组织总蛋白进行Western Blotting，采用蛋白裂解液试剂盒，按说明书进行操作，远红外荧光扫描成像系统扫描并测定目标带单位密度，β-actin做为参照，以ERK1/2、p-ERK1/2 对β-actin 的比值代表各组蛋白相对表达水平。

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资 料数据用均数±标准差来表示，多组间差异的比较采用 单因素方差分析，然后组间差异的两两比较采用LSD-T 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

如表 1结果所示，模型组神经功能评分明显高于评分为0的假手术组，表明缺血再灌注造成了明显的神经功能缺损。Apelin-13处理后，肌力明显增强，干预B，C组神经功能评分明显低于模型组（P<0.05），干预A组与模型组差异均无统计学意义（P>0.05），提示较大剂量Apelin-13能够改善局灶性脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失。

表 1(Table 1)

表 1 不同组大鼠Longa神经功能评分 Table 1 Longa neurological function score in different groups Group 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Model group 2.84±0.34 2.91±0.27 3.38±0.31 3.30±0.35 2.52±0.24 A group 2.61±0.24 2.81±0.32 3.21±0.40 2.98±0.31 2.34±0.26v B group 2.32±0.31 2.43±0.26 1.89±0.18 1.26±0.13 0.91±0.12* C group 2.01±0.21 1.85±0.22 1.32±0.24 0.98±0.12 0.68±0.09* *P<0.05 vs Model group, vP>0.05 vs Model group.

表 1 不同组大鼠Longa神经功能评分 Table 1 Longa neurological function score in different groups

如图 1结果所示，假手术组大鼠脑组织TTC染色表现为均匀一致的红色，模型组缺血再灌注侧脑组织TTC染色出现大范围苍白色梗死区域。缺血损伤的体积中模型组为236±21 mm³，A 组187±19 mm³、B 组175±17 mm³、C组152±15 mm³，Apelin-13干预后梗死区域体积缩小（P<0.05），提示Apelin-13能够减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后的梗死体积，从而产生神经保护作用。

图 1(Figure 1)

图 1 肉眼所见不同组别大鼠的梗死脑组织 Figure 1 Infarcted brain tissue of rats in different groups under the naked eye.

如图 2 结果所示，模型组脑组织含水量（82.34±0.83）%明显高于假手术组（73.27±0.63）%（P<0.05），提示大脑中动脉缺血再灌注后造成了明显的脑水肿。不同剂量的Apelin-13 处理后，B组含水量（78.36±1.14）%、C 组含水量（75.78±1.01）%明显低于模型组（82.23±0.83）%（P<0.05），A组含水量（81.32±0.91）%与模型组差异无统计学意义（P>0.05），提示中、大剂量Apelin-13能够减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织水肿。

图 2(Figure 2)

图 2 各组脑组织含水量 Figure 2 Brain water content of different groups (%). *P< 0.05vs Sham group; #P>0.05 vs Model group; *P<0.05 vsModel group.

如图 3结果所示，光镜下观察，假手术组脑组织切片见细胞形态完整，未见TUNEL阳性细胞。模型组梗死周围组织明显水肿、坏死，可见深染、固缩核细胞。运用Apelin-13 干预后，C组TUNEL阳性细胞数（27.30±2.028/每高倍视野）、B组TUNEL 阳性细胞数（31.48±3.178/每高倍视野）明显低于模型组（42.67±3.458/每高倍视野）（P<0.05）；A 组TUNEL 阳性细胞数（40.74±1.158/每高倍视野）与模型组差异无统计学意义（P>0.05），提示中、大剂量Apelin-13能够减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后的细胞凋亡。

图 3(Figure 3)

图 3 不同组别大鼠TUNEL阳性细胞观察 Figure 3 Observation of TUNEL-positivecells in different rats (A-E, Originalmagnification: × 200). Sham group; B:Model group; C: A group; D: B group;E: C group; F: TUNEL-positive cells perfield (*P>0.05 vs Model group, #P<0.05vsModel group).

如表 2结果所示：与假手术组比较，模型组大鼠缺血周边区脑组织中MDA含量显著性增加，SOD活性显著性降低（均P<0.05）；与模型组比较，干预B、C组大鼠缺血周边区脑组织中MDA水平均显著降低，SOD活性均显著增加，以C组更加明显（P<0.05）；干预A组脑组织中MDA含量及SOD活性与模型组比较没有显著性差异（P>0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 不同组别大鼠脑组织MDA含量和SOD活性 Table 2 MDAcontent and SOD activity in different groups (n=5) Group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot) Sham group 325.68±19.21 12.54±2.34 Model group 112.32±15.28* 50.25±4.56* A group 125.54±16.32# 48.32±3.68# B group 250.25±18.02v 36.28±3.52v C group 301.28±18.36v 20.12±2.84v *P<0.05 vs sham group, #P>0.05 vs Model group, vP<0.05 vs Model group.

表 2 不同组别大鼠脑组织MDA含量和SOD活性 Table 2 MDAcontent and SOD activity in different groups (n=5)

如图 4结果所示，Western blotting结果显示，各实验组均有ERK1/2蛋白表达，模型组与假手术组相比，表达无统计学差异（P>0.05），提示局灶性脑缺血再灌注损伤对脑组织中ERK1/2 蛋白总量无明显影响。Apelin-13 干预后结果显示，各干预组与假手术组ERK1/2表达差异无统计学意义（P>0.05）。另外各实验组均有p-ERK1/2表达，模型组和干预组p-ERK1/2蛋白表达高于假手术组（P<0.05），而且干预组高于模型组（P<0.05）；提示局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中ERK1/2蛋白磷酸化水平增强，Apelin-13干预后ERK1/2蛋白磷酸化水平增强更加明显。表明Apelin-13对局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织ERK1/2蛋白总量无明显影响，但能促进ERK1/2蛋白磷酸化。

图 4(Figure 4)

图 4 不同组别大鼠ERK1/2和p-ERK1/2蛋白电泳情况 Figure 4 Expression of ERK1/2 and p-ERK1/2 in differentrats. *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs Model group.

动脉粥样硬化所致的心肌梗塞、脑梗塞等缺血性组织损伤是导致病人死亡的主要原因，研究表明缺血-再灌注损伤加重了脑缺血疾病对机体的损害^[9]，增加了死亡率和致残率。其机理十分复杂，氧化应激、过量自由基的产生是重要原因^[10-12]。再灌注神经损伤的严重程度主要取决于缺血梗死面积、持续时间以及内源性神经保护机制的启动。寻找一种新的安全有效的防治脑缺血-再灌注损伤的方法具有十分重要的意义。

Apelin是由Tatemoto等从牛的胃分泌物中分离纯化的一种小分子内源性神经肽，是血管紧张素受体样蛋白J 受体（putative receptor protein related to theangiotensin receptor ATl,APJ）的天然配体。Apelin/APJ系统在神经元的胞体和神经纤维中均有大量的表达^[13-14]，具有神经保护作用，能对抗兴奋性毒性损伤、氧化应激损伤，抑制神经细胞的凋亡等，是一种内源性神经保护因子。不同长度的Apelin多肽片段在体内的分布、与APJ的结合能力、体内外生理与药理作用都不尽相同。Apelin能抑制大脑皮质细胞中活性氧的产生、细胞色素C 的释放以及caspase-3 的激活，促进Akt 和ERKl/2的磷酸化，抑制大脑皮质细胞凋亡，减少Ca2+积聚，降低钙蛋白酶calpain的活化，保护大脑皮质神经元抵抗谷氨酸的兴奋性毒性损伤^[15]。

Apelin前体肽在蛋白水解酶的作用下可分解为长度不同的多肽片段，以Apelin-13 生物活性最强^[16-17]。Apelin-13在神经系统的表达水平较高，与神经系统疾病的关系非常密切。本研究采用Apelin-13对脑缺血-再灌注损伤大鼠进行治疗，其结果显示，Apelin-13改善了脑缺血-再灌注损伤大鼠模型的临床症状、神经功能缺损，增强肌力，显著性降低了脑组织的含水量和脑水肿的程度，也显著性降低神经功能评分和脑梗死体积和比例。同时本研究通过TUNEL染色对缺血周边脑组织神经细胞凋亡进行观察发现，中、大剂量Apelin-13干预后，TUNEL阳性细胞明显减少，表明Apelin-13可抑制局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡。

机体在遭受有害刺激时出现氧化应激反应，产生了大量的活性氧自由基，超出了机体对其清除能力，从而对细胞的DNA、蛋白质和脂质等造成巨大的损伤。MDA是活性氧发生脂质过氧化的终产物，是衡量机体内细胞发生氧化应激的指标之一。SOD是清除体内活性氧自由基的主要自由基清除剂，通过催化超氧化物发生岐化反应而清除自由基^[18]。本研究结果显示干预B组和C组通过Apelin-13处理明显抑制了缺血周边脑组织中氧化应激的产生，降低了MDA含量，显著增加了SOD的活性。结果表明Apelin-13 抑制了氧化应激反应达到保护脑缺血-再灌注损伤。与以往的研究发现Apelin能通过抗氧化应激^[19]，对抗肌萎缩性侧索硬化症的进展，发挥神经保护作用相一致

ERK介导的细胞信号转导通路可能是多种刺激的共同通路。本实验研结果显示，脑缺血再灌注后，脑组织中ERK1/2总量并未发生明显的改变，而ERK1/2磷酸化水平增强，说明ERK1/2的活化在脑缺血再灌注中扮演了重要角色。本实验对Apelin-13的研究中发现，Apelin-13处理对缺血再灌注脑组织有保护作用，表现在减轻神经功能缺损、脑水肿以及抑制细胞凋亡。同时发现Apelin-13处理后进一步增加了脑组织ERK1/2的磷酸化水平，提示p-ERK1/2可能在脑缺血再灌注后扮演着一个保护性的角色；同时也提示，Apelin-13干预在脑缺血再灌注后发挥一系列保护作用可能与ERK1/2蛋白活化相关。

总之，本研究表明Apelin-13对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤有保护作用，其机制可能与Apelin-13抑制氧化应激有关。Apelin-13是防治脑缺血-再灌注损伤的一种有效途径和新的方法，为脑缺血-再灌注损伤提供了新的治疗靶点和策略。