近年来，分子影像已成为医学影像技术新的研究领域，而基因显像是其中重要组成部分，其中基因显像又包括直接基因显像和间接基因显像，即反义基因显像和报告基因显像，前者即将放射性核素标记的反义探针转染进靶细胞，利用核素显像仪器使得靶细胞内目标基因得到显像，从而达到在基因水平对疾病的定性、定位诊断的目的^[1]。最近的研究表明，miRNA208b在未发生形态学改变的早期肥大心肌细胞内高表达，且具有高度心肌特异性^[2]，而现行的检查方法只能探查已发生形态学改变后的肥大心肌细胞，依然缺乏一种早期的检查手段，根据反义显像原理，若能将核素标记的AMO转染进高表达miRNA208b的心肌细胞内，并与之杂合，就有可能达到早期肥大心肌细胞显像的目的。本实验过程以期为下一步在体早期肥大心肌细胞显像提供实验基础。

Sep-PakC18 反相层析柱，美国Waters；GeneQuant DNA/RNA calculator，美国Pharmacia Biotech公司；SN-682型放射免疫γ计数器，上海核福光电仪器有限公司；KDC-2044低温冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；高锝酸盐⁹⁹Tc^mO₄-淋洗液，原子高科股份有限公司；阳离子脂质体转染剂（Lipofectamine2000），美国Invitrogen公司；1~3 d龄雄性SD小鼠，购自南方医科大学动物实验中心，动物批号SCXK（粤）2011-0015。

首先从Genbank 中搜索到大鼠心肌细胞miRNA208b 的基因序列为5'-ATAAGACGAACAAAAGGTTTGT-3'，根据碱基配对原则，合成针对miRNA208b的AMO，并经LNA修饰。

将NHS-MAG₃溶于无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成浓度为10 mg/mL的溶液。取150 μg的LNA- AMO于60 ℃水浴中静置10 min，溶解于150 mmol/L 的无菌NaHCO₃ 缓冲液（pH=8.5）中，最终浓度为5 μg/μL。将NHS-MAG₃以摩尔比为20∶1的比例逐滴加入LNA-AMO溶液中，边滴加边震荡。最终配比液室温静置1 h后经Sep-Pak C18反相层析柱洗脱，洗脱液为30%的乙腈溶液（溶于0.1 mol/L乙酸胺），收集洗脱液，按每管10 μg 分装，经GeneQuant DNA/RNA calculator测定各收集管在260 nm波长处的吸光度值，冷冻干燥后-20 ℃储存备用。

取一管NHS-MAG₃-LNA- AMO溶液溶解于50 μL0.25 mol/L的碳酸氢盐缓冲液中，快速依次加入100 μL的N-三甲基甘氨酸（tricine）溶液（70 mg/mL）、3 μL溶于0.1 mmol/L 盐酸的SnCl₂.2H₂O溶液以及高锝酸盐⁹⁹Tc^mO₄-淋洗液（约185 MBq），室温下摇匀3 h，标记完毕。标记物经Sep-Pak C18反相层析纯化，用生理盐水洗脱，经SN-682型放射免疫γ计数器测定洗脱液的放射性计数，经快速小型纸层析法测得纯化后标记率大于84%，放化纯度大于86%。纸层析法的固定相为whatmanNo.1层析纸，展开剂为V（丙酮）：V（2 mol/L Hcl）=4∶1。

取等量纯化后的标记物，分别溶解于2倍体积的新鲜人血清、生理盐水中，孵育12 h，用快速小型纸层析法分别测定在2、4、6、8、12 h的放化纯度，根据不同孵育时间放化纯度的改变以评估标记物的稳定性。而分子杂交活性的测定是将纯化后标记物与miRNA208b 靶向基因核酸在室温下反应1 h后测定放射性计数，与未杂合的标记物对比，比较两者放射性峰值位置分布的改变。

将新生SD乳鼠经颈椎脱臼法处死，迅速取出心脏，预冷生理盐水清洗血迹，滤纸吸干后，剪去心房及右心室，用眼科剪剪碎左心室组织，加入消化液（胰蛋白酶及I型胶原酶），于培养振荡器中消化20 min，弃去上清液，重复多次消化后，最终沉淀用RPMI 1640培养液分散成单细胞悬液，经差速贴壁后富集心肌细胞，调节细胞密度均匀种于培养皿，加入RPMI 1640培养液以及AngⅡ10^-9 mol/L，在37 °C、5% CO₂饱和湿度条件下培养，分别在培养0、12、24 h时取细胞于6孔培养板上，每孔1×10⁵细胞，在相差显微镜下用测微器测量心肌细胞直径，每孔观察10个视野，每个视野观察10个细胞，测平均值。

将AngII诱导培养了0、12、24 h的心肌细胞分别转移至EP管中，加Trizol提取总RNA，步骤按RT-PCR试剂盒示：体系包括待测RNA1 μg，RT产物1 μL、Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）5 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL及RNase-free H₂O 混合至10 μL。PCR循环反应参数为：95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s，以U6为内参，测定miRNA208b相对表达量。

将4.0 μg ⁹⁹Tc^m-NHS-MAG₃-LNAAMO及10 μL阳离子脂质体转染剂Lipofectamine分别稀释于25 μL不含血清及抗生素的RPMI 1640培养液，前者即为a液，后者于室温下孵育10 min，即为b液。将a液与b液混合均匀，室温下放置30 min后，将混合液加入有心肌细胞（培养12 h时）的培养板各孔内，轻轻震荡混匀，置入培养箱内，在37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下培养，分别于3、6、9 h检测细胞的放射性计数，计算细胞内放射性滞留率。

所有数据用均数±标准差表示，使用统计软件SPSS 19.0，组间比较用两独立样本t检验，P<0.05有显著意义。

NHS-MAG₃-LNA-AMO经Sep-Pak C18反相层析柱洗脱后的洗脱液，利用核酸在260 nm处具有增色效应的特点，经Gene Quant DNA/RNA calculator测定其在此波长区域的吸光度，结果图谱中显示两处波峰，分别在第12及30管处出现，即由洗脱液中核酸所引发，这亦说明了收集的产物为目标产物。

标记纯化后的标记物，分别在新鲜人血清、生理盐水中孵育12 h，测定在2、4、6、8、12 h 的放化纯度，检测放化纯度如图 1、2，由图可看出标记物在新鲜人血清、生理盐水中，孵育12 h后，其放化纯度均大于80%，稳定性良好。

图 1(Figure 1)

图 1 标记物在新鲜血清中孵育后放化纯度的改变 Figure 1 Changes of radiochemical purities of the labeledcompounds after incubation in fresh serum.

图 2(Figure 2)

图 2 标记物在生理盐水中孵育后放化纯度的改变 Figure 2 Change of radiochemical purities of labeledcompounds after incubation in normal saline.

标记物经Sep-Pak C18反相层析纯化后测量洗脱液放射性计数如图 3a，标记物与miRNA208b靶基因杂合，纯化后检测洗脱液放射性计数，如图 3b。根据Sep-Pak C₁₈反相层析的原理，不同物质按照极性由强至弱的顺序先后被洗脱。杂合后的标记物极性变弱，被洗脱的顺序靠后，致其放射性峰值向后推移，间接说明了制备的标记物具有与靶基因杂合的能力。

图 3(Figure 3)

图 3 杂合前后的标记物放射性计数变化 Figure 3 Radioactive count of the labeled compoundsbefore (a) and after (b) hybridization.

通过AngⅡ诱导心肌肥大模型，于0、12、24 h时测定心肌细胞直径分别为19.252±1.80、20.761±1.76、27.176±1.28 μm，后两组差异有统计学意义（_P<0.05），而前两组差异无统计学意义（_P>0.05），表明心肌细胞于24 h时已发生肥大的形态学改变，而12 h时心肌细胞尚处于早期肥大阶段。镜下心肌细胞形态（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 经AngⅡ诱导不同时间后镜下心肌细胞形态 Figure 4 Morphology of AngII-induced cardiac myocytes at 0 (A), 12 h (B), and 24 h (C) during induction (Original magnification: ×100).

利用qRT-PCR扩增技术测定经AngⅡ诱导培养0、12、24 h的心肌细胞内miRNA208b的相对量，如图 5，可见12 h时miRNA208b相对表达量高于其他时段，且由2.4结果可知，此时心肌细胞正处于早期肥大阶段。

图 5(Figure 5)

图 5 qRT-PCR 扩增技术测定心肌细胞内miRNA208b的相对表达量 Figure 5 The relative expression of miRNA208b in thecardiac myocytes detected by qRT-PCR.

脂质体-⁹⁹Tc^m-NHS-MAG₃-LNA-AMO复合物与经AngⅡ诱导培养12 h时的离体肥大心肌细胞作用后分别于3、6、9 h检测细胞放射性滞留率，结果分别为13.48±2.59、26.73±1.84及15.62±2.96，两者作用6 h时放射性滞留率达到最高，且大于20%，表明复合物在细胞内停留时间较长，这为后续细胞的显影提供更大的可能性。

核素显像是一种成熟显像技术，被研究较多的核素有¹²⁵I、¹⁸F、¹¹¹In、¹¹³In、¹⁸⁸Re、^99mTc等，其中^99mTc是核医学领域应用最广的核素，如Hnatowith等^[3]成功将⁹⁹Tc^m标记于DNA，Kang等^[4]将⁹⁹Tc^m标记于siRNA，通过无创性方式使得siRNA在体的信息传递过程可视化，且标记物放化纯度大于92%。^99mTc可通过99Mo/⁹⁹Tc^m发生器产生，较其他核素，其放射剂量较小，具有较高的探测率^[5]，除此之外，其半衰期适中、显像清晰、价格实惠更是其优势，因而被越来越多的学者应用于分子影像领域。miRNA是近年在真核生物细胞中发现的一种小的高度保守非编码RNA分子，主要通过与靶基因mRNA的碱基配对来调节基因表达^[6-7]，从而在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起重要作用。miRNA208包括miRNA208a和miRNA208b，是目前发现唯一在心脏特异性表达的miRNA，分别由_α-心肌肌球蛋白（_α-MHC）重链基因（Myh6）和_β-心肌肌球蛋白（β-MHC）重链基因（Myh7）编码，两者的比重变化对心肌肥大的进展起到重要作用^[8]。

未经修饰的AMO不稳定，容易降解，为增强其细胞通透性、膜内稳定性以及亲和力，需对其进行修饰，修饰物如LNA（带锁核酸）、2'-OMe（2'-0-甲基）、2'-MOE（2'-0-甲基乙基）、2'-氟（2'-F）、MORF（吗啡样结构）^[9]、PNA（肽核酸）等，本研究选用LNA修饰AMO，因为其具有高亲和力，且结合物具有更好的细胞通透性、稳定性和特异性^[10]。同时又因裸AMO无法直接携带金属离子，因此进行核素标记时必须借助双功能螯合剂介导，常见的螯合剂例如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）、肼基联氨基烟酰胺（HYNIC）以及N-羟基琥珀酰亚胺-巯基乙酰基三甘氨酸（NHS-MAG3），早在1985年Hnatowith等^[11]便用DTPA作为抗体蛋白核素标记的螯合剂，后于1997年Winnard等^[12]应用二步法合成巯基被乙酰基保护的S-acetyl-NH3-MAG₃，成功将^99mTc 标记于DNA，2008年Li等^[13]证明NHS-MAG₃的标记产物的标记率和稳定性显著高于HYNIC，同时与血浆蛋白的结合率远低于HYNIC，故本研究选用NHS-MAG₃作为螯合剂。寡核苷酸作为亲水性阴离子多聚体，难以通过带负电荷的细胞膜且易被胞浆内的核酸酶水解，带正电荷的脂质体作为基因载体，因其可以提高转染率，并保护其内的核酸免遭核酸酶分解，而得到广泛应用^[14-15]。

本实验证明了早期心肌肥大阶段约于模型建立12 h左右，此时心肌细胞尚未发生明显形态改变且miRNA208b表达特异性升高，奠定了早期心肌肥大核素显像的理论基础。我们最终通过双功能螯合剂NHS-MAG3的介导以及LNA的修饰，成功将^99mTc标记于反义miRNA208b的寡核苷酸（AMO），并通过脂质体载体将AMO复合物转染进早期肥大心肌细胞，这为后续以miRNA208b 为靶点的早期肥大心肌细胞核素显像提供了重要的实验基础。