STOML-2 是stomatin 家族的新成员，具有stomatin 家族共有的一致序列，但不具有N 端跨膜区域，因此，STOML-2发挥功能的机制可能与其他成员不同^[1-2]。STOML-2 定位于线粒体内膜，其在食管癌、肺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤均高表达^[3-4]，但其在宫颈癌组织中表达量的高低文献报道不一^[5-9]。我们实验室采用免疫组化、Real time-PCR以及Western blot检测宫颈癌组织中的表达情况，发现癌组织中STOML-2 的表达都比对应的癌旁组织高^[8]，但对其抑制宫颈癌细胞凋亡的机制尚未进行研究，且国内外均未见相关报道。本实验以人宫颈鳞癌Siha细胞为研究对象，以腺病毒为载体介导STOML-2 过表达，研究其对细胞增殖的影响以及抑制宫颈癌细胞凋亡的机制。

人宫颈鳞癌Siha细胞由南方医院肿瘤科实验室惠赠，RPMI 1640 培养基（Hyclone），四季青胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），STOML-2腺病毒及空载体腺病毒（美国ViGene Biosciences），顺铂（江苏豪森药业），MTT（Sigma），Hoechst33258（武汉谷歌生物），兔抗人α-tubulin（enogene）、兔抗人caspase3 及cleaved-cas- pase3 抗体（CST）、兔抗人Cytochrome C、Bcl-2、Bax 抗体（abcam）、羊抗兔荧光二抗（LI-COR）。

将Siha细胞常规培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，在37 ℃、饱和湿度及含5% CO₂的培养箱中传代培养。

将Siha 细胞按照20 万/孔接种于6 孔板上，过夜细胞贴壁后换液，按MOI（multiplicity of infection）=50 将腺病毒加入完全培养基中感染细胞，72 h后提取全蛋白，采用Western blot检测STOML-2的表达。

取对数生长期的Siha 细胞，将细胞按7000/孔接种于96 孔板上，每孔200 μL 完全培养基，设5 个复孔，按MOI=50 将腺病毒加入全培中感染细胞，72 h 后每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，避光、37 ℃孵育4h，小心去掉孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测定吸光值（X=490 nm），实验重复3次以上。

取对数生长期的Siha细胞，将细胞按7000 个/孔接种于96 孔板上，每孔200 μL 完全培养基，设5 个复孔，72 h 后换成顺铂终浓度为0、2.5、5、10、20、30、40、50、60 μg/mL 的完全培养基，继续培养24 h 后每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT溶液，避光、37 ℃孵育4 h。小心去掉孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测定吸光值（X=490 nm），抑制率（%）=（处理组-调零孔）（/ 对照组-调零孔)×100%，取其平均值。实验重复3次以上。

取对数生长期的Siha 细胞，将细胞按7000/孔接种于96 孔板上，每孔200 μL 完全培养基，设3 个复孔，按MOI=50 将腺病毒加入全培中感染细胞，48 h 后换成顺铂终浓度为15 μg/mL 的完全培养基，继续培养24 h 后，去上清，室温下用4%多聚甲醛固定液固定30 min，用PBS 洗涤3 次，每孔加入50 μL 的Hoechst33258 避光条件下染色15 min，再用PBS 洗涤3 次，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化。

取对数生长期的Siha 细胞按照20 万/孔接种于6 孔板上，过夜细胞贴壁后换液，按MOI=50 将腺病毒加入全培中感染细胞，72 h 后换成顺铂终浓度为15 μg/mL 的完全培养基，继续培养6 h 后，收集细胞，用AnnexinV-FITC 和PI 标记，用流式细胞仪检测，分析凋亡细胞的比例。

取对数生长期的Siha 细胞按照100 万/皿接种于大皿，过夜细胞贴壁后换液，按MOI=50 将腺病毒加入全培中感染细胞，72 h 后换成顺铂终浓度为15 μg/mL的完全培养基，继续培养24 h后，按照全蛋白试剂盒和细胞线粒体分离试剂盒收集并裂解细胞，得到细胞全蛋白、线粒体蛋白及胞浆蛋白，用BCA 法对蛋白样品进行定量。取等量蛋白样品用12% SDS-PAGE 进行电泳，恒压将蛋白转至PVDF 膜。室温下将膜在含5%脱脂奶粉的TBST 溶液中封闭l h，按照适当的稀释度加入一抗，4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h，应用Western bolt 检测系统测定caspase3、cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax 以及线粒体内外Cyt C 的表达水平。

采用SPSS20.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 认为差异具有统计学意义。

Western bolt 结果如图 1 所示，用携带STOML-2 基因的腺病毒转染Siha 细胞72 h 后STOML-2 的表达明显增加，说明外源性的STOML-2 基因可以在Siha 细胞中过表达。

图 1(Figure 1)

图 1 腺病毒感染Siha 细胞72 h 后STOML-2 的表达 Figure 1 Expression of STOML-2 after transfection in Siha cells. 1: Blank group; 2: Empty vector transfection group; 3: Overexpression group.

MTT 结果显示，STOML-2 过表达后明显促进Siha 细胞的增殖，同空白组和空载体组相比，结果具有显著统计学差异（0.545 ± 0.080 vs 0.548 ± 0.010 vs 0.636 ±0.057，P<0.0001），而空白组与空载体组无统计学差异。

用不用浓度的顺铂处理Siha 细胞24 h 后，MTT 结果显示，随着顺铂浓度的增加，其对Siha 细胞的杀伤率越来越高（图 2），计算得IC₅₀≈15 μg/mL。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度的顺铂对Siha 细胞的杀伤作用 Figure 2 Changes in the viability of Siha cells after treat- ment with cisplatin.

细胞发生凋亡时往往出现细胞核形态的改变。用终浓度为15 μg/mL 的顺铂处理Siha 细胞24 h 后，其Hoechst33258染色结果如图 3所示，空白组和空载体组细胞表现为凋亡细胞的细胞核大小不一，浓染致密的蓝色荧光显示核固缩，部分核裂解为凋亡小体，而过表达组细胞核多较完整，着色较浅，染色质密度均匀一致，说明经同浓度的顺铂处理后STOML-2 过表达组细胞凋亡减少。

图 3(Figure 3)

图 3 荧光显微镜下观察STOML-2 过表达后对Siha 细胞形态的影响 Figure 3 Fluorescence microscope of morphological changes of Siha cells after Cisplatin exposure (Original magnification: ×400).A: Blank group; B: Blank group+Cisplatin; C: Empty vector transfection group+Cisplatin; D: Everexpression group+Cisplatin.

用终浓度为15 μg/mL 的顺铂作用于Siha 细胞6 h后，收集细胞，采用AnnexinV-FITC/PI 双染，上机检测细胞凋亡。结果如图 4 所示，与空白组及空载体组相比，过表达组早期凋亡率明显减少且具有统计学差异（36.30±5.72 vs 39.77±7.34 vs 9.10±5.16，P<0.01），且总凋亡率也明显减少且具有统计学差异（51.40±4.80 vs 61.53±7.17 vs 20.30±9.96，P<0.01），空白组与空载体组相比早期凋亡率及总凋亡率均无统计学差异。

图 4(Figure 4)

图 4 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞分析 Figure 4 Flow cytometry analysis for Annexin V-FITC/PI staining. 1: Blank group + Cisplatin; 2: Empty vector transfection group + Cisplatin; 3: Overexpression group+Cisplatin.

如图 5，6 所示，经顺铂作用24 h 后，与空白组和空载体组相比，过表达组与凋亡直接相关的cleaved-cas- pase3、线粒体外Cyt C及Bax的表达水平降低，而对应的caspase-3、线粒体内Cyt C及Bcl-2的表达水平则升高。

图 5(Figure 5)

图 5 Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达 Figure 5 The expression of apoptosis-related proteins in Siha cells detected by Western blot. 1: Blank groupl 2: Blank group + Cisplatin; 3: Empty vector transfection group + Cisplatin; 4: Overexpression group+Cisplatin.

图 6(Figure 6)

图 6 Western blot 检测线粒体内外细胞色素C 的表达 Figure 6 Levels of Cyt-C releas from mitochondria to cytosol in Siha cells detected by Western blotting． 1:Blank group; 2: Blank group + Cisplatin; 3: Empty vector transfection group + Cisplatinl 4: Overexpression group + Cisplatin. A: Mitochondria; B: Cytosol.

STOML-2在食管癌、肺癌、子宫内膜癌及宫颈癌等多种恶性肿瘤广泛高表达^[3-4]，说明了其在恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。我们使用腺病毒感染宫颈鳞癌Siha 细胞后MTT 结果提示STOML-2 过表达可以进Siha 细胞的增殖。用顺铂诱导各组细胞凋亡后用Annexin V 法检测显示过表达组早期凋亡率及总凋亡率均明显低于对照组，而我们以前用HeLa、HCC94 细胞株沉默STOML-2 后早期凋亡率及总凋亡率均明显高于对照组，说明STOML-2 在宫颈鳞癌细胞中起着抑制凋亡的作用，而STOML-2抑制肿瘤细胞凋亡的机制，国内外均未见相关报道。

Rezaul 等^[10]研究发现STOML-2 存在于线粒体内。随后，两个独立的研究小组^[11-12]进一步报道STOML-2 定位于线粒体内膜，本实验通过提取线粒体内外蛋白采用Western blot 也同时证实了STOML-2 主要存在于线粒体内。在哺乳类动物的细胞中线粒体通路是凋亡发生时的主要信号通路，在发生细胞外应激和细胞内损伤如DNA损伤时启动^[13]。当细胞受到细胞内外的凋亡诱因刺激启动线粒体凋亡途径时，Bcl-2/Bax 介导的线粒体外膜通透(MOMP)使线粒体内一些可溶性的蛋白如Cyt C 从线粒体内膜释放至细胞质内。Cyt C 结合至单体的凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1，进而使得Apaf-1 的空间构象发生改变并聚合为多聚体结构。Caspase-9前体与Apaf-1 多聚体结合形成凋亡体，凋亡体的形成能激活Caspase-9，通过Caspase-9 介导的蛋白裂解作用，最终激活了Caspase-3，诱导细胞凋亡的发生。

本实验进一步用顺铂处理STOML-2 过表达的Siha细胞后检测线粒体凋亡途径相关蛋白的变化，结果显示STOML-2 过表达后Bax/Bcl-2 的比率降低，从线粒体释放到胞浆中的细胞色素C 减少，使cleaved-cas- pase3也减少，说明STOML-2过表达可以抑制肿瘤细胞的凋亡，并且其抑制细胞凋亡的机制可能是通过线粒体凋亡途径进行。

综上所述，STOML-2 过表达可以促进Siha 细胞的增殖，STOML-2可能通过线粒体凋亡途径抑制肿瘤细胞的凋亡，更为完整的机制有待进一步实验证实。