瘢痕是皮肤创伤愈合的必然结果，给患者带来了外观畸形、感觉异常甚至器官功能障碍，一直没有特别有效的治疗方法，主要是因为对其机制研究尚不清楚。目前普遍认为转化生长因子-β（TGF-β）介导的信号通路是促使创伤愈合、瘢痕形成关系最密切的机制^[1]； TGF-β可刺激皮肤成纤维细胞（FB）增殖并分泌细胞外基质（ECM），导致瘢痕生成；这种作用一旦失控，则伤口过度愈合并发展为病理性瘢痕^[2]。血小板源性生长因子（PDGF）是创伤后释放的另一种重要的细胞因子，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖，在创伤修复过程中起重要的作用^[3]。有研究显示，PDGF 可以促进FB 表达TGF-β受体Ⅱ（TβRⅡ），使FB 对TGF-β的敏感性增加^[4-5]，与TGF-β协同促进瘢痕形成。核因子Ⅰ（NFI）是哺乳动物体内广泛存在的一类转录因子，目前发现的有A、B、C、X 四种亚型。有研究表明，敲除NFI-C后，PDGF通路及TGF-β通路明显增强^{[6, 7]}，导致伤口愈合加速；但NFI-C过表达对这两条通路及瘢痕形成的影响未见报道。本实验首次通过慢病毒转染技术构建NFI-C 过表达FB，研究NFI-C 是否可抑制PDGF 对TβRⅡ的上调作用，降低伤口愈合过程中FB 对TGF-β 的敏感性，从而为临床改善瘢痕及抗病理性瘢痕的基因治疗提供新思路。

人皮肤成纤维细胞株HFF-1 细胞（ATCC）。

DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰酶（Gibco）；；PDGF-BB（PeproTech）； Blasticidin 、Trizol 液（Invitrogen）；Polybrene（Sigma）； MTS 试剂盒（Promega）；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、 BCA 蛋白定量试剂盒、ECL Prime 蛋白印迹试剂（Thermo）；0.45 μm PVDF 膜（Millipore）；抗人TβRⅡ、抗人NFI-C、抗人GAPDH、辣根过氧化物酶标记的二抗（CST）；逆转录试剂盒（Fermentas）；SYBR Green Super Mix（Bio-rad）；TβR Ⅱ引物（上游：5'-GTC GCT TTG CTG AGG TCT AT AA-3'，下游：5'-CTC TGT CTTCCA AGA GGC AT AC-3）'及内参基因GAPDH 引物（上游：5'-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT-3'，下游： 5'-GCC TCA AGA TCA TCA GCA AT-3）'（上海生工）。

CO₂恒温培养箱、NanoDrop 3300微量紫外分光光度计（Thermo）；普通光学显微镜和IMT-2倒置显微镜（OLYMPUS）；EXL808 全自动酶标仪（BIO-TEK）；ABI 7500 Real Time PCR System（ABI）。

HFF-1 细胞培养于含15%胎牛血清、1%双抗（青霉素+链霉素）的DMEM 高糖培养基，置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱培养。每隔2~3 d 换液1 次，当细胞长满90%培养皿时采用胰酶消化，以1∶3 的比例传代。取P3代HFF-1细胞，加入30 ng/mL的PDGF-BB作用24 h，采用Western blot 检测PDGF-BB 处理及未处理HFF-1细胞表达TβRⅡ的差异。

人NFI-C 序列为NCBI 数据库CR536507.1（1500 bp）。慢病毒NFI-C（Lenti-GFP-NFI-C）以及含有空载体的阴性病毒（Lenti-GFP）均委托美国Invitrogen ^TM—Life Technologies 公司（上海）构建。取P3 代、对数生长期的HFF-1 按5×10³/孔接种于96 孔板，贴壁后更换含6 μg/mL Polybrene 的无血清培养基，将Lenti-GFP-NFI-C 按转染复数（multiplicity of infection,MOI）0、5、10、30、50、100 转染HFF-1，每组设15 孔，37 ℃、5% CO₂下转染6 h后更换完全培养液。常规培养8d，于0、2、4、6、8 d 采用MTS 法于490 nm 测吸光度值，各时相点每MOI取3孔测定；转染96 h后于荧光倒置显微镜下观察表达GFP 的细胞，以GFP 阳性细胞占总细胞的比例作为转染效率；以生长活性抑制低、感染效率高确定最佳MOI值。

取对数生长期P3 代HFF-1 细胞，用无血清DMEM 培养基洗1 次，换无血清培养基孵育24 h 使细胞同步于G₀ 期，然后弃上清，分成2 个实验组，即Lenti-GFP- NFI-C 转染组和未转染组；转染组按最佳MOI 进行转染。转染6 h 后更换为完全培养基，于第4 天采用western blot法测定两组细胞NFI-C蛋白的表达。

取对数生长期P3代HFF-1细胞，转染前准备同上，分为5 组：（1）NFI-C 转染组：将Lenti-GFP-NFI-C 按照最佳MOI 转染HFF-1 细胞，待筛选出稳定转染细胞后用30 ng/mL PDGF-BB 刺激24 h；（2）阴性病毒组：将Lenti-GFP 按照最佳MOI 转染HFF-1 细胞，待筛选后用30 ng/mL 的PDGF-BB 刺激24 h；（3）PDGF 组：HFF-1 细胞单用30 ng/mL PDGF-BB 刺激24 h；（4）单纯NFI-C 转染组：将Lenti-GFP-NFI-C 按照最佳MOI 转染HFF-1细胞，并筛选稳定转染细胞；（5）空白对照组：不做任何处理。转染的细胞于转染48 h 后加入0.05 μg/mL Blasticidin筛选稳转细胞，每2~3 d换液，1周后换完全培养基并在（1）、（2）、（3）组中加入PDGF-BB继续培养24 h。

取1.2、1.4、1.5 中各组细胞用冰预冷的PBS 重复洗涤2 次，吸干洗涤液。加入细胞裂解液及1%蛋白酶抑制剂冰上裂解15 min，收集裂解液于4 ℃、1400 r/min离心7.5 min。收集上清液，BCA法进行蛋白定量。按蛋白量40 μg/孔进行10% SDS-PAGE凝胶电泳（80 V 20 min，150 V 约1.5 h）并转膜（400 mA 1.5 h）至PVDF 膜。于5%脱脂奶粉室温封闭1 h，剪膜后分别加入1∶1000稀释的一抗，4 ℃过夜；TBST 洗膜（5 min×3 次），加相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h；充分洗膜后用ECL Prime 蛋白印迹试剂进行化学发光显色，X 片曝光显影。用美国Bio-Rad 公司Quantity One 软件对Western条带进行定量分析，读取积分光密度值。

取1.5 中各组细胞，用Trizol 液常规提取总RNA，使用微量紫外分光光度计测定RNA 的含量及260 和280 nm 的吸光度（A）值，控制A₂₆₀/A₂₈₀ 在1.9~2.1。取2μg 总RNA 参照逆转录试剂盒说明书进行cDNA 合成，然后应用ABI 7500 Real Time PCR System 进行扩增。PCR 反应体系：cDNA 50 ng，2 × SYBR Green Super Mix 12.5 μL，引物300 nmol/L，补水至25 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃复性30 s，循环40 次。设定65 ℃为荧光检测点，进行扩增。用基于内参物GAPDH 的相对定量分析，目的基因mRNA表达量用2^-△△Ct计算转录水平的差异。

所有实验数据均为独立重复3 次实验后得到的平均值，数据分析用SPSS 19.0 软件以均数±标准差表示，采用单因素方差分析、LSD-t 检验分析各MOI组转染效率及生长活性数据；单因素方差分析、SNK-q 检验分析各处理组组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

HFF-1 细胞经PDGF-BB 处理后，其TβRⅡ条带与GAPDH 灰度值比值为0.59±0.03，高于未处理细胞0.29±0.05，且差异有统计学意义（n=3，P<0.05）。

图 1(Figure 1)

图 1 PDGF作用HFF-1细胞24 h的TβRⅡ变化 Figure 1 Expression of TβR II in HFF-1 cells 24 h after PDGF treatment. A: PDGF-treated cells; B: Untreated cells.

慢病毒转染后3 d，细胞GFP 表达良好（图 2）；转染细胞NFI-C条带与GAPDH灰度值比值为1.07±0.13（图 3A），高于未转染细胞0.23±0.03（图 3B），差异有统计学意义（n=3，P<0.05）。不同MO（I 0、5、10、30、50、100）转染HFF-1 细胞的转染效率及生长活性分别（图 4，5），结果发现MOI 从50 增至100 时细胞生长抑制明显加重，而转染效率升高差异无统计学意义（P>0.05），因而最佳MOI为50。

图 2(Figure 2)

图 2 慢病毒转染HFF-1细胞后表达GFP Figure 2 Expression of GFP in HFF-1 cells after lentiviral transfection (Original magnification: ×100). A: HFF-1 cells expressing GFP; B: Bright field image of the same field of vision.

图 3(Figure 3)

图 3 Lenti-GFP-NFI-C转染HFF-1细胞后NFI-C的表达情况 Figure 3 Expression of NFI-C in HFF-1 cells after transfection with Lenti-GFP-NFI-C. A: Lenti-GFP-NFI-C -transfected group; B: Non-transfected group.

图 4(Figure 4)

图 4 Lenti-GFP-NFI-C转染后各MOI组转染效率 Figure 4 Changes of transfection efficiency with increased MOIs of lenti-GFP-NFI-C. *P>0.05 vs MOI of 50; **P<0.05 for comparisons among MOIs of 5,10,30,and 50.

图 5(Figure 5)

图 5 Lenti-GFP-NFI-C转染后各MOI组细胞生长曲线 Figure 5 Cell growth curves after Lenti-GFP-NFI-C transfection with increased MOIs. *P<0.05 for comparison of MOI of 100 with MOIs of 5,10,30,and 50.

Western blot 显示：NFI-C 转染组TβR Ⅱ条带与GAPDH 的比值为0.39±0.06（图 6A），低于阴性病毒组（0.62±0.11）（图 6B）和PDGF 组（0.66±0.10）（图 6C），差异具有统计学意义（n=3，P<0.05）；且阴性病毒组与PDGF 组之间无显著性差异（n=3，P>0.05）；单纯NFI-C转染组（0.322 ± 0.002）（图 6D）与空白对照组（0.325 ± 0.019）（图 6E）之间亦无显著性差异（n=3，P>0.05）。RT-qPCR 显示：NFI-C 转染组TβR Ⅱ mRNA 水平与GAPDH 的比值为0.24±0.12，低于阴性病毒组（0.73± 0.13）和PDGF 组（0.81±0.12），差异具有统计学意义（n=3，P<0.05）；阴性病毒组与PDGF 组之间亦无显著性差异（n=3，P>0.05）；单纯NFI-C 转染组（0.15±0.04）与空白对照组（0.17±0.04）之间亦无显著性差异（n=3，P>0.05）。

图 6(Figure 6)

图 6 PDGF作用Lenti-GFP-NFI-C转染、Lenti-GFP转染以及未转染的HFF-1细胞24 h后TβRⅡ蛋白水平变化 Figure 6 Expression of TβRII protien in different groups. A: Lenti-GFP-NFI-C-transfected cells; B: Negative control cells; C: PDGF-treated cells; D: Lenti-GFP-NFI-C-transfected cells without PDGF treatment; E: Blank control group.

皮肤创伤后，各种细胞因子激活FB 是瘢痕形成的关键机制。目前普遍认为，在创伤后的早期从分子水平干预被激活的FB，可能会有效改善瘢痕的形成，并从根本上解决这一临床难题。因此，发现创伤早期干预分子来调节瘢痕形成具有重要的意义。TGF-β通路过度激活会导致FB过度增殖，ECM大量沉积，最终发展为病理性瘢痕^[2]，因而TGF-β通路是抗瘢痕治疗的重要靶位^[8-9]。组织中的TGF-β必须先与细胞表面的TβRⅡ结合才能激活下游基因表达，因而TβRⅡ是TGF-β通路的关键转导分子；病理性瘢痕的重要特征之一是FB 对TGF-β的敏感性上升；而通过竞争性抑制TβRⅡ则表现出良好的抗瘢痕效果^[10]。

NFI 家族属于转录复制因子，是编码位置特异性的转录因子，在众多真核生物不同组织、器官、细胞的基因表达方面均发挥着重要的作用^[11]。NFI-C是NFI家族成员，早期研究发现，NFI-C 的缺失可促进TGF-β1 的表达，从而导致小鼠牙根发育异常^[12]。Lee 等^[7]发现，在小鼠成牙质细胞中加入TGF-β1可诱导NFI-C降解。近年Plasari 等发现，NFI-C 敲除后TGF-β通路基因表达明显上调，伤口愈合明显加速^[6]以及毛囊形成受阻^[13]，而毛囊等皮肤附属器缺失是瘢痕的特征之一；此外，该研究还发现敲除NFI-C 的小鼠PDGF 通路激活明显增强^[6]。PDGF 是创伤早期释放的一种细胞因子，具有促进FB增殖、ECM 生成等作用^[14]，抑制PDGF 及其受体可有效缓解肺及肾纤维化进程^[15-16]。PDGF是由A、B两条链组成的二聚体，分别构成PDGF-AA、PDGF-AB 和PDGF-BB 3 种亚型；PDGF 受体（PDGF receptor,PDGFR）也是由α、β两条链组成的二聚体；PDGF-AA 只能结合αα二聚体受体，PDGF-AB 能结合αα、αβ二聚体受体，PDGF-BB 能结合αα、αβ、ββ二聚体受体，因而PDGF-BB 在3 者之中作用效果最强。PDGF 3 种亚型均可上调TβRⅡ，增强FB 对TGF-β的敏感性^[4]；而病理性瘢痕的形成往往伴随着PDGF 表达异常增高以及FB对其反应性增强^[14]。本研究采用PDGF-BB作用于人皮肤成纤维细胞，结果发现其TβRⅡ表达较未处理细胞明显升高，与文献报道一致。分析其原因，可能是由于PDGF 可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外调节蛋白激酶、MAPK/ ERK 激酶（MEK）以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）等通路^[17]，这些下游通路同时参与TGF-β通路的自身正反馈放大途径；其中MEK 的激活可直接导致TβRⅡ表达上调^[18]，PI3-K 激活可导致瘢痕疙瘩FB 侵袭性增强^[19]；此外，PDGF-BB 刺激可显著提升组蛋白乙酰化的水平^[20]，这一过程亦可诱导TβRⅡ表达^[21]。可见PDGF 通路与TGF-β通路在伤口愈合过程中是相互协调的，这种平衡一旦被打破，就有可能造成伤口过度愈合或不愈合；而NFI-C紧密联系着这两条通路的相互作用。

本研究采用慢病毒载体转染FB，相对于腺病毒载体具有表达时间长、宿主免疫反应小、细胞毒性小、能转染非分裂细胞等优势，利于在转染之后筛选得到高纯度的过表达细胞株。结果显示，FB 在转染后可稳定表达NFI-C；在PDGF-BB刺激下，NFI-C转染的FB表达TβR Ⅱ明显低于阴性病毒组和PDGF 组；但在没有PDGF 的条件下，NFI-C 转染并不影响TβRⅡ的基础性表达；而阴性病毒组和PDGF组之间的差异无统计学意义，表明NFI-C 可显著抑制PDGF 导致的TβRⅡ上调，降低FB 对TGF-β的敏感性，且慢病毒转染本身不具有这种抑制作用。国外研究表明PDGF 可上调TβRⅡ mRNA 稳定表达，进而提升其蛋白水平^[4-5]；在本实验中，NFI-C 使PDGF 作用后的FB 表达TβRⅡ mRNA 水平下降程度大于其蛋白水平，表明NFI-C 主要在转录水平抑制PDGF 对TβRⅡ的上调作用。其机制还不清楚，笔者推测NFI-C 可能通过与抑制上述的PDGF 下游信号通路、 与转录因子竞争性结合TβRⅡ基因启动子位点或者募集转录抑制因子等途径来抑制TβRⅡ基因表达^[11]。此外，PDGFR 的α、β链可激活不同的通路，且在伤口愈合过程中PDGFR β 链的表达显著高于α 链^[4]；而敲除NFI-C 的细胞主要表现为PDGFR α链的上调^[6]；因而PDGF促进TβRⅡ表达的确切途径以及NFI-C在这两条通路之间作用的具体机制仍十分复杂，有待进一步研究。

综上所述，慢病毒载体介导的NFI-C 能有效抑制PDGF 上调皮肤FB 表达TβRⅡ，从而降低其对TGF-β 的敏感性，这一结果为改善瘢痕形成提供1 种新的潜在干预分子，并为今后临床抗瘢痕的基因治疗提供新思路。PDGF 及TGF-β通路是创伤后的两条关键通路，过度激活或者过度抑制分别会导致伤口的过度愈合或不愈合，因此如何控制基因转染之后NFI-C 对PDGF 及TGF-β通路的抑制作用在一个适当范围内，使其不至于作用过度而影响伤口正常愈合依然需要研究。与以往敲除性实验不同，本研究首次构建NFI-C 过表达细胞株，这对细胞的其他影响尚不明确，将来可行动物实验进一步探讨其安全性和有效性。