孤独症又称儿童自闭症，是一种脑发育障碍疾病，临床特征主要体现在婴幼儿期出现的交往障碍、语言障碍和重复刻板行为等。孤独症的发病率约千分之五^[1]。目前国内约有60多万孤独症儿童，男孩多于女孩，且发病率还呈上升趋势^[2]。孤独症的发病涉及遗传、免疫、环境、教育、饮食等多方面因素，至今尚未完全阐明^[3]。因此，目前针对孤独症的治疗主要以不典型抗精神病药如奥氮平等、针刺疗法、按摩、高压氧、音乐治疗等为主^[4]，尚无明确的治疗方案及特效药物。

近年的研究表明，孤独症患者脑组织中多种信号通路发生紊乱，如与神经系统发育密切相关的Wnt信号通路^[5]、与神经细胞生长相关的PI3K/AKT/MTOR信号通路^[6]以MAPK信号通路^[7]等。尤其是Wnt信号通路，不仅在孤独症患者中存在Wnt2基因编码序列突变现象^[8]，在孤独症模型大鼠的脑组织中也发现Wnt信号通路处于超激活状态^[9]，而且将Wnt信号通路中关键基因散乱蛋白（Dishevelled-1,Dvl-1）敲除后的小鼠也表现出类似孤独症的行为症状^[10]。因此，抑制Wnt信号通路的过度激活可能是改善孤独症行为症状的可行途径，但相关研究目前尚未见报道。由于非甾体抗炎药物舒林酸可以与Dvl-1中的PDZ结构域特异性结合而抑制其活性，从而抑制Wnt信号通路^[11]，因此本研究拟以孤独症大鼠为模型，探讨舒林酸对孤独症大鼠病症的改善作用。

本实验所用Wistar 大鼠（合格证号：SYXK（渝）2012-0002）由第三军医大学实验动物中心提供。成年SPF级Wistar雌性大鼠（体质量200~250 g）10只，雄性大鼠（体质量300~350 g）10只，子代雄性大鼠（出生后35 d，体质量80~100 g）30只，饲养于第三军医大学实验动物中心。

丙戊酸钠（Sodium valproate，VPA）、舒林酸购自Sigma，Gsk3β、磷酸化Gsk3β（Ser 9）、β-catenin 抗体、GAPDH抗体购自Cell Signaling，细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司，PVDF膜为美国Bio-Rad产品；蛋白相对分子质量标准及免疫组化试剂盒购自北京中衫公司。

参照Schneider等^[12]的方法，将雌、雄大鼠合笼过夜，次日早晨对雌鼠进行阴道涂片检查，发现阴栓者记为妊娠第1天，并将孕母鼠单独饲养。在第12.5天按600 mg/kg剂量腹腔一次性注射VPA，对照组孕鼠腹腔注射等量的生理盐水。模型组孕鼠产下的幼鼠即为孤独症模型组，而对照组孕鼠产下的幼鼠即为对照组。参照Xing等^[13]的方法，把舒林酸溶于芝麻油（终浓度为40 mg/mL）中并将其渗入常规颗粒性大鼠饲料中，在第12.5天后按照每天20 mg/kg 体质量的比例饲喂母鼠直至仔鼠断奶（出生后23 d），其它小组喂服含等剂量溶剂（芝麻油）的饲料，幼鼠出生后第1天记为P1。

在幼鼠出生后35 d，分别从每组各选择6只进行检测。检测鼠均为雄性，出生时间相同，体质量差别小于15 g，分笼饲养。检测在大小为60 cm×60 cm×60 cm的透明三室箱内进行。实验前1 d，所有被检测鼠放入检测室适应环境。实验时将1只被测鼠放入中间小室先适应10 min。然后在左侧小室空铁丝笼子，右侧小室放入陌生幼鼠并用同样的铁丝笼子罩住。打开中间小室进入左、右小室的通道，摄像记录10 min内被检测鼠的行为，通过Any-Maze软件系统分别统计被检测鼠自梳理（非社交行为）、嗅铁丝笼子和陌生鼠（社交行为）时间。

同样在幼鼠出生后35 d检测，分别从模型组与对照组各选择5只进行检测，被检测大鼠的选择标准同1.2.2。检测在大小为25 cm×25 cm×38 cm的封闭箱内进行，箱子中央12 cm×12 cm区域为中央区。实验前1 d，所有被检测鼠放入检测室适应环境。检测时将被检测鼠放入检测箱中央，摄像记录5 min内被检测鼠的行为，通过Any-Maze软件系统分别统计被检测鼠在中央区活动时间及直立次数。

将出生后35 d的幼鼠断颈处死，立即分离前额叶皮层、海马和小脑组织。将各组织分别按100 mg/mL比例加入组织裂解液进行匀浆。冰上静置30 min后于4 ℃ 12 000 r/min离心30 min。取上清，测定蛋白浓度后置-80 ℃冰箱备用。将含50 μg总蛋白的组织样品经变性后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后再转移到PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭后加入一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后再加入二抗，室温孵育1 h。再经漂洗后加入化学发光液进行曝光显影。

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所有数据均用均数±标准差表示，采用单因素方差分析后两两比较检验。

对社会交往能力测试结果分析发现（表 1），与正常对照组相比，VPA处理组的社会交往能力显著下降（P=0.000），体现为与陌生幼鼠交往减少，不愿接触新事物，自我梳理时间增加，符合孤独症儿童的行为特点。舒林酸单独处理组与对照组相比社会交往能力无显著差异（P=0.630）；而舒林酸联合处理则可以显著改善VPA处理导致的社会交往能力下降（P=0.003）。

表 1(Table 1)

表 1 各处理组大鼠的社交活动时间统计分析结果 Table 1 Statistic analysis of social interaction time in different groups（n=6） Group Time of social interaction（Mean±SD, min） Time of non-social interaction（Mean±SD, min） P within group Control 6.11±0.62 3.89±0.62 0.000 VPA 3.58±0.97** 6.42±0.97** 0.000 Sulindac 5.91±0.48¤¤ 4.09±0.48¤¤ 0.000 VPA+Sulindac 4.94±0.66**¤¤▼ 5.06±0.66**¤¤▼ 0.744 P inter-group 0.000 0.000   Compared to control group, *P<0.05; **: Compared to control group, P<0.01; ¤: Compared to VPA group, P<0.05; ¤¤: Compared to VPA group, P<0.01; ▼: Compared to sulindac group, P<0.05;▼▼: Compared to sulindac group, P<0.01.

表 1 各处理组大鼠的社交活动时间统计分析结果 Table 1 Statistic analysis of social interaction time in different groups（n=6）

如表 2所示，正常对照组在非中央区活动时间显著高于中央区（P=0.000），而VPA处理组在中央区活动时间与非中央区活动时间无明显差异（P=0.392），与对照组差异明显（P=0.003），符合孤独症的行为特点。舒林酸单独处理组与对照组相比活动方式无显著差异（P=0.074）；而舒林酸联合处理则可以减少孤独症大鼠在中央区活动时间（P=0.010），明显改善孤独症幼鼠的活动方式。

表 2(Table 2)

表 2 各处理组大鼠的中央区活动时间统计分析结果 Table 2 Statistic analysis of the time moving in central region in different groups (n=6) Group Time of social interaction（Mean±SD, min） Time of non-social interaction（Mean±SD, min） P within group Control 1.02±0.24 3.98±0.24 0.000 VPA 2.64±0.54** 2.36±0.54** 0.392 Sulindac 1.45±0.39¤¤ 3.55±0.39¤¤ 0.000 VPA+Sulindac 2.00±1.34**¤¤▼ 3.00±0.34**¤¤▼ 0.00 P inter-group 0.000 0.000   Compared to control group, *P<0.05; **: Compared to control group, P<0.01; ¤: Compared to VPA group, P<0.05; ¤¤: Compared to VPA group, P<0.01; ▼: Compared to sulindac group, P<0.05;▼▼: Compared to sulindac group, P<0.01.

表 2 各处理组大鼠的中央区活动时间统计分析结果 Table 2 Statistic analysis of the time moving in central region in different groups (n=6)

正常对照组的站立次数显著高于VPA处理组（P=0.000），而舒林酸联合处理则可以明显增加孤独症大鼠的站立次数（P=0.013）。

分别提取各组大鼠的前额叶皮层、海马和小脑组织蛋白进行Western blot。结果如图 1所示，与正常对照组相比，VPA处理组的前额叶皮层、海马和小脑组织中Wnt信号通路的β-catenin蛋白表达水平及Gsk3β的第9位丝氨酸磷酸化水平明显增强，而舒林酸单独处理组及VPA与舒林酸的联合处理组中β-catenin的表达水平与Gsk3β的第9位丝氨酸磷酸化水平明显下降，表明舒林酸处理可改变孤独症大鼠前额叶皮层、海马和小脑组织中Wnt信号通路关键蛋白的表达，这种改变可能对Wnt信号通路起抑制作用。

图 1(Figure 1)

图 1 Western blot分析各组大鼠前额叶皮层、海马和小脑组织中β-catenin和Gsk3β表达水平 Figure 1 Expression levels of β-catenin and Gsk3β in the prefrontal cortex, hippocampus and cerebellum in different groups.

目前有多种用于孤独症研究的动物模型，如Dvl-1基因敲除鼠模型、VPA药物处理模型、病毒感染模型等^[14]。这些模型中，VPA一次性注射模型是一种目前公认的较理想的孤独症动物模型。该模型在行为上可以模拟孤独症的重复、刻板等行为特征，且脑组织的病理变化也与孤独症病人尸检报告相似。社会交往实验是检测模型动物社会交往能力的经典实验，实验中的空笼子与陌生鼠分别代表了新事物与新伙伴，通过统计分析规定时间内被检测鼠与陌生鼠、空笼子接触及自我梳理时间，从而判断其社会交往能力^[15]。本研究中，经VPA处理的模型鼠社会交往能力明显减弱，与孤独症症状相符。神经行为学检测实验中，在中央区所呆时间反映了被测动物的神经兴奋性，正常鼠具有避开中央区、在四周角落中探寻的习惯，而孤独症鼠则相对愿意呆在中央区；站立次数反映了被测鼠在新环境中的探索能力，正常鼠站立次数多、探索能力强，而孤独症鼠则站立次数减少、探索能力减弱^[15]。本研究中VPA处理的孤独症模型鼠也具有相似的行为特征。VPA诱导大鼠发生孤独症的药理机制目前尚不明确。本实验结果表明，VPA可以抑制大鼠前额页、海马与小脑组织中的Gsk3β磷酸化，增加β-catenin的表达，从而增强Wnt信号通路活性，这与Dvl-1基因敲除孤独症模型鼠中Wnt信号通路活性的表现相一致，也与陈明军等的报道相符^[16]，表明Wnt信号通路过度激活可能是VPA诱导孤独症发病的重要机制。

Wnt信号通路对神经系统的发育具有重要调控作用。在发育早期，Wnt信号通路对神经细胞的增殖、分化、迁移、凋亡及突触的形成均具有调控作用^[17]。因此，一旦Wnt信号通路被抑制或过度激活均会对神经细胞的发育造成影响，进而引发神经发育障碍疾病的发生。许多孤独症患者存在Wnt2编码序列基因突变^[8]，敲除Wnt信号通路中Dvl-1基因的小鼠，也表现出社交行为和感觉运动障碍^[10]，Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠，神经管闭合不全^[18]，而catenin转基因小鼠，则能使神经前体细胞增殖，导致巨大脑、脑皮质容量增加^[19]，这些研究结果均强烈提示Wnt通路与孤独症的发病密切相关。本研究结果也表明，孤独症模型大鼠脑组织中经典Wnt通路被过度激活，这可能与孤独症的发病密切相关。

舒林酸是一种非甾体抗炎药，它本身活性极小，经生物转化后发挥作用。Lee等^[11]的研究进一步发现，舒林酸可以与Wnt信号通路中关键蛋白Dvl中的PDZ结构域特异性结合，从而抑制Wnt信号通路。已有研究表明，舒林酸不仅具有抗肿瘤作用，同时还对阿尔海默滋病、心肌缺血再灌注损伤有治疗作用^[20-21]。但目前尚没有舒林酸改善孤独症症状的相关报道。本实验结果表明，舒林酸处理后大鼠前额叶皮质、海马及小脑组织中β-catenin的表达水与Gsk3β的第9位丝氨酸磷酸化水平明显下降。因此，舒林酸可能通过对Wnt信号通路的抑制来改善孤独症的病症，这一结果为孤独症的治疗提供了一定的理论与实验依据。