慢性粒细胞白血病（CML）是一种多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病，其具有特征性的染色体异位t（9，22）（q34，q11），能产生Bcr/Abl 融合基因，编码蛋白质P210^[1] 。近年来，酪氨酸激酶抑制剂的应用对CML治疗效果有很大改善，但对慢粒急变的治疗效果仍不乐观。因此，寻找新治疗方法仍是CML研究的目标。K562细胞系是从1例处于急变期的CML患者胸水中分离并建立的，其同时具有CML细胞和急性粒细胞白血病细胞的特点，是筛选抗白血病药物的常用细胞模型。

三七是中医学上一味名贵的药材，主要作用为止血补血。三七总皂苷（PNS）是从三七的根中提取出主要活性成分，其主要成分包括三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd等。目前研究表明，PNS及其单体具有防治动脉硬化^[2] 、抗抑郁^[3] 、抗阿尔茨海默病^[4] 、抗糖尿病^[5] 和抗高血压^[6] 等多种功能。近年来，PNS抗肿瘤作用倍受关注，有研究表明PNS可抑制结肠癌^[7] 、肝癌^[8] 等癌细胞增殖，并且有抑制乳腺癌细胞的迁移的作用^[9] 。但是，有关PNS对K562细胞影响的研究较少，本实验将研究PNS对体外培养K562细胞的作用，并初步探讨其相关的分子机制。

胎牛血清、RPMI 1640培养基（Gibco），凋亡及周期检测试剂盒（碧云天），MTT（Sigma），Annexin V-FITC/PI 试剂盒（南京凯基），PCR引物（南京金斯瑞），一抗cleaved caspeas-3、cyclin D1、Fas、mTOR、p-mTOR（Ser2448）、p70S6K、p-p70S6K（Thr229/389）、4E-BP1、p-4E-BP1（Thr37/46）（Affinity Biosciences），HRP标记的羊抗兔IgG、HRP 标记的羊抗鼠IgG（Santa Cruz）。PNS（南京广润）用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基溶解并稀释浓度为5 mg/mL，4 ℃保存。

K562 细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中培养。以下各项实验使用对数生长期细胞进行。

将K562 细胞接种于96 孔培养板，5000/孔，加入PNS稀释液，补齐培养基至100 μL/孔，设置对照组，及PNS分别为50、100、200、400、800 μg/mL的5个实验组，设5个复孔，并设置空白孔。MTT法检测24、48、72 h的细胞存活率。细胞存活率=（A_给药-A_空白）/（A_对照-A_空白）。实验重复3次。根据细胞存活率计算PNS对K562细胞的IC₅₀值，根据ID₅₀值并对比其他研究人员的用药浓度，选取低、中、高3个药物浓度组进行以下实验。

将K562细胞接种于六孔板，浓度为6×10⁵/孔，使用不同浓度的PNS（0、100、200、400 μg/mL）处理，培养48 h后离心收集各组全部细胞，以PBS调整细胞浓度为10⁶/mL，各组皆吸取混匀的细胞悬液100 μL，然后加入浓度为100 μg/mL 的AO、EB 染液各2 μL，吹打混匀，取50 μL涂于载破片上，使用荧光显微镜观察细胞核的颜色形态变化。

K562细胞分组及加药情况同1.4，48 h后离心收集细胞。以PBS洗涤后加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，再加入5 μLAnnexin V-EGFP混匀后加入5 μL PI，设置空白对照组和单色对照组。混匀室温避光反应15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

K562 细胞分组及加药情况同1.4，48 h 后收集细胞，预冷PBS洗涤1次，加入预冷的70%乙醇固定细胞12 h，PBS洗涤1次后收集细胞于流式管，加入预先配置好的含有RNase A和PI的染色液0.5 mL，缓慢并充分重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min，随后冰浴放置并用流式细胞仪检测在488 nm激发波长下红色荧光和光散射情况。实验重复3次。

分组及加药情况同1.4，孵育72 h，提取各组细胞总蛋白，使用SDS-PAGE法对变性后的蛋白进行电泳，转膜后室温封闭2 h，一抗分别为cleaved caspeas-3、cyclin D1、Fas、mTOR、p70S6K及4E-BP1，4 ℃孵育过夜。使用TBST 洗膜3 次，二抗37 ℃孵育2 h。再用TBST 洗膜3 次后使用ECL 进行显色，随后使用BIO-RA胶成像仪曝光，检测条带灰度值（蛋白相对表达量=目的条带灰度/内参条带灰度×100%）。

细胞接种浓度同1.4，对照组不加药，3 h后收集细胞提取总蛋白，实验组PNS浓度为200 μg/mL，分别在加药1、2、3 h 后提取总蛋白，检测mTOR 总蛋白（t-mTOR）的蛋白量，及p-mTOR（Ser2448）、p-p70S6K（Thr229/389）、p-4E-BP1（Thr37/46）等磷酸化蛋白量，方法同1.8.1。p-mTOR（Ser2448）相对表达量=p-mTOR 条带灰度值/t-mTOR 条带灰度× 100% 。p-p70S6K（Thr229/389）、p-4E-BP1（Thr37/46）相对表达量=目的条带灰度/对照条带灰度×100%。

表 1(Table 1)

表 1 待测基因引物序列、退火温度及扩增长度 Table 1 Primer sequences,annealing temperature and amplified fragment length of the target genes in RT-PCR Primer Sequences Tm (℃) Length (bp) GAPDH F: 5'-CAAGGTCATCCATGCAACTTTG-3' R: 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' 58 496 mTOR F: S'-CGCTGTCATCCCTTTATCG-S' R: 5'-ATGCTCAAACACCTCCACC-3' 53 193 p70S6K F: 5,-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3, R: 5'-GATGAAGGGATGCTTTACT-3' 49 188 4E-BP1 F: 5'-ACCGGAAATTCCTGATGGAG-3' R: 5'-CCCGCTTATCTTCTGGGCTA-3' 55 156

表 1 待测基因引物序列、退火温度及扩增长度 Table 1 Primer sequences,annealing temperature and amplified fragment length of the target genes in RT-PCR

分组加药情况及培养时间同1.7.1，提取总RNA，每组取2 μg 逆转录合成cDNA，对各组样本内参基因GAPDH及目的基因mTOR、p70S6K、4E-BP1进行PCR扩增。预变性为94 ℃ 5 min；变性为94 ℃ 35 s，退火温度见表 1，时间为35 s，延伸为72 ℃ 35 s，进行30 个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用BIO-RAD凝胶成像仪检测电泳结果。计算各组目的mRNA的相对表达量（相对表达量=目的条带灰度/内参条带灰度值×100%）。

统计数据皆采用均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS 17.0软件，采用单因素方差分析法进行组间比较，采用SNK法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

MTT 实验结果显示（图 1），PNS 浓度为100~800 μg/mL，作用时间分别为24、48、72 h时，其对K562细胞增殖的具有明显的抑制作用，且具有时间和药物浓度依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。PNS的IC₅₀为229.07±2.36 μg/mL。根据此结果，以下将使用100 μg/mL作为低浓度组，200 μg/mL作为中浓度组，400 μg/mL作为高浓度组进行实验。

图 1(Figure 1)

图 1 PNS对K562细胞存活率的影响 Figure 1 Effects of PNS on the survival rate of K562 cells.

经AO/EB染色后镜检发现，PNS作用后，K562部分细胞核发生了固缩及碎裂（图 2A，B），其红色荧光细胞数目较对照组增多，且红色荧光的细胞数目所占的比例随着药物浓度的增加而增加（图 2C、D、E、F）。Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率结果显示（图 3），浓度为100、200、400 μg/mL的PNS作用于K562细胞48 h后，早期凋亡与晚期凋亡的细胞总和分别为（8.5±1.9）%、（15.6±2.3）%、（33.4±2.7）%，与对照组（3.2±0.7）%相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。使用Western blot法对凋亡相关蛋白的表达量进行检测，发现Fas 蛋白的变化没有统计学意义（P＞0.05），而cleaved caspase-3 的表达量增加（P＜0.05，图 5）。结果提示PNS 能过上调cleaved caspase-3 的表达，促进K562细胞发生凋亡。

图 2(Figure 2)

图 2 AO/EB双荧光染色检测PNS对K562细胞的凋亡影响 Figure 2 Apoptosis of K562 cells detected by AO/EB after treatment with PNS for 48 h. A,C: Control; B,F: PNS (400 μg/mL); D: PNS(100 μg/mL). E: PNS (200 μg/mL). 1: Normal cell; 2: Early apoptotic cell; 3: Late apoptotic cell; 4: Dead cell. A,B: Originalmagnification: ×400; C,D,E,F: Original magnification: ×200.

图 3(Figure 3)

图 3 PNS对K562细胞的凋亡影响 Figure 3 Effects of PNS on the apoptosis of K562cells. A: Control; B: PNS (100 μg/mL); C: PNS(200 μg/mL); D: PNS (400 μg/mL); E:Proportion of apoptotic cells. *P＜0.05,**P＜0.01 vs control.

流式细胞仪检测结果显示（图 4），随着PNS浓度的升高，S期及G₂/M期的细胞比例逐渐减少，而G₀/G₁期的细胞比例逐渐增多。差异有统计学意义（P＜0.05，表 2）。使用Western blot 法检测G₀/G₁期周期蛋白cyclinD1 的表达变化，发现PNS 作用于K562 细胞72 h 后，cyclin D1 蛋白的表达量降低（P＜0.05，图 5）。这说明PNS能够下调cyclin D1的表达，将K562细胞周期阻滞在G₀/G₁期。

图 4(Figure 4)

图 4 PNS对K562细胞的周期影响。 Figure 4 Effects of PNS on cell cycle of K562 cells. A: Control; B: PNS(100 μg/mL); C: PNS(200 μg/mL); D: PNS(400 μg/mL).

表 2(Table 2)

表 2 流式细胞仪检测三七总皂苷作用48 h后K562细胞的周期变化 Table 2 Cell cycle distribution detected by FACS cytometry in K562 cells treated with PNS for 48 h (%,Mean±SD,n=3) PNS concentration (μg/mL) G0/G1 S G2/M 0 27.60±1.14 52.31±1.73 20.09±1.08 100 32.66±1.93** 49.87±1.45* 17.47±1.33** 200 36.46±1.68** 48.91±1.12* 13.63±1.37** 400 42.98±2.08** 46.69±1.26* 8.33±1.19** *P＜0.05 vs control, **P＜0.01 vs control.

表 2 流式细胞仪检测三七总皂苷作用48 h后K562细胞的周期变化 Table 2 Cell cycle distribution detected by FACS cytometry in K562 cells treated with PNS for 48 h (%,Mean±SD,n=3)

图 5(Figure 5)

图 5 PNS对K562细胞cleaved caspase 3、cyclin D1、Fas 、mTOR、p70S6K和4E-BP1的蛋白表达的影响 Figure 5 Effects of PNS on the expression of cleaved caspase 3,cyclin D1,Fas,mTOR,p70S6K and 4E-BP1 in K562 cells. A: Westernblot analysis; B: Quantitative analysis of the relative expression of cyclin D1,mTOR and cleaved caspase 3 protein. *P＜0.05 ,**P＜0.01 vs control.

有研究表明cyclin D1蛋白的表达与mTOR信号通路的活性具有相关性，因此本实验对mTOR通路主要蛋白的基因表达水平及蛋白表达水平进行了检测。使用100~400 μg/mL PNS 作用K562 细胞72 h 后，RT-PCR结果显示（图 6）：mTOR mRNA的相对表达量与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义。而p70S6K和4E-BP1 的mRNA 变化没有统计学意义（P＞0.05）。Western Blot检测结果显示（图 5），mTOR蛋白表达下降（P＜0.05），而p70S6K及4E-BP1 这两种蛋白没有明显变化（P＞0.05）。由于mTOR信号通路分子的活性状态为磷酸化蛋白，故本实验检测了mTOR、p70S6K 及4E-BP1 3种蛋白的磷酸化水平，结果显示，200 μg/mLPNS 能够显著降低K562 细胞中mTOR、p70S6K 和4E-BP1 3种蛋白的磷酸化水平（图 7，P＜0.05）。实验结果提示PNS 能够抑制mTOR mRNA 的转录，下调mTOR蛋白的表达，抑制mTOR、p70S6K及4E-BP1这3种蛋白磷酸化，从而降低mTOR信号通路的活性。

图 6(Figure 6)

图 6 PNS对K562细胞mTOR、p70S6K及4E-BP1 mRNA表达水平的影响 Figure 6 Effects of PNS on the expression of p-mTOR,p-p70S6K and p-4E-BP in K562 cells. A: RT-PCR analysis; B: Relativeexpression of mTOR mRNA. *P＜0.05,**P＜0.01 vs control.

图 7(Figure 7)

图 7 PNS对K562细胞p-mTOR、p-p70S6K及p-4E-BP1蛋白表达水平的影响 Figure 7 Effects of PNS on the expression of p-mTOR,p-p70S6K and p-4E-BP in K562 cells. A: Western blot analysis; B: Relativeexpression of p-mTOR,p-p70S6K and p-4E-BP1 proteins. **P＜0.01 vs control.

抑制肿瘤细胞的增殖对治疗癌症有至关重要的作用，近年来研究发现PNS能够有效抑制多种癌细胞增殖。Wen等^[8] 研究得出，200 μg/mL 的PNS能够明显抑制SMMC-7721、BEL-7402 和HepG2 三株肝癌细胞增殖，但对正常肝细胞株L-02 没有显著的增殖抑制作用。Wang等^[10] 研究发现，浓度为250 μg/mL的PNS对结肠癌HCT-116细胞的72 h抑制率为27.6%，但对大鼠肠上皮细胞没有明显的抑制作用。本结果显示，PNS对K562细胞有明显的增殖抑制作用，且此作用具有浓度和时间依赖性。综合上述结果可知PNS能够抑制多种肿瘤细胞增殖，但其对正常细胞的抑制作用不明显。

为了研究PNS抑制K562细胞增殖的具体原因，我们采用A0/EB 双荧光染色法观察，发现药物作用后K562细胞的细胞核出现了固缩及裂解，这提示细胞存在凋亡变化，而Annexin V-FITC/PI双染色法也证实了PNS 对K562 细胞的促凋亡作用。同时，我们发现cleaved caspase-3蛋白在用药后的K562细胞中表达增加，这进一步证明了PNS对K562细胞的促凋亡作用。

我们发现PNS作用后，G₁期周期蛋白cyclin D1表达下降，K562细胞发生了G₀/G₁期阻滞。与我们的研究结果相同的是，PNS中的单体人参皂苷25-OCH₃-PPD能将A549、H358及H838这3株肺癌阻滞在G₀/G₁期^[11] 。但与我们的研究结果不同的是，PNS中的单体人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1能将结肠癌细胞SW480阻滞在S期及G₂/M期^[10] 。造成这种差异的原因可能是PNS含有多种单体，其作用的靶点可能有多个。因为对于三七总皂苷，不同地区的产品乃至不同的提取工艺都可能导致其单体比例的差异，从而导致不同的作用效果。综合以上研究结果可知，PNS能够通过促进肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期来抑制K562细胞的增殖。

mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它与p70S6K 及4E-BP1 同属mTOR信号通路的主要信号蛋白。p70S6K（40S 核糖体S6 蛋白激酶）和4E-BP1（真核启动因子4E结合蛋白1）的磷酸化水平受到mTOR复合体的调节，二者活化后将进一步调节蛋白质的合成，影响细胞的增殖、凋亡和周期等生理活动^[12] 。mTOR信号通路的过度激活与多种癌细胞如乳腺癌细胞、肺癌细胞及白血病细胞等的增殖、转移分化紧密相关^[13] 。作为慢粒细胞的特征性融合蛋白，Bcr/Abl具有很强的酪氨酸激酶活性^[13] ，可激活体内多种信号通路，而在Bcr/Abl介导的细胞癌变过程中，mTOR 信号通路发挥着关键作用^[14-15] 。研究发现，在Bcr/Abl表达阳性的白血病细胞株中，mTOR信号通路处于激活状态，且其下游的信号分子p70S6K和4E-BP1磷酸化水平也很明显升高^[16] 。磷酸化的4E-BP1 与eIF4E分离，而eIF4E主要调节cyclin D1、Myc等蛋白质的翻译。

Li 等^[17] 使用雷帕霉素抑制K562 细胞的mTOR信号通路活性后，发现K562 细胞增殖受到抑制，凋亡增加，活性caspase-3表达上调，且细胞被阻滞在G₀/G₁期，cyclin D1 表达下降，这与我们的研究结果非常相似。因此我们推测PNS有类似雷帕霉素的作用，我们通过检测PNS对K562细胞mTOR信号通路的影响，发现PNS能够降低了K562 细胞mTOR 的转录量，从而抑制mTOR蛋白的表达，与此同时，K562细胞mTOR信号通路的磷酸化水平也受到了抑制。这提示PNS是通过抑制mTOR信号通路的活性，来抑制K562细胞增殖，促进其凋亡并且使其发生周期阻滞。

三七总皂苷作为一种中草药提取物，由于其作用靶点复杂，药理作用尚未完全明确，因此将其作为临床化疗药物的辅助用药更为有益。Yu等^[18] 发现PNS能够增强顺铂对Hela细胞的毒性作用，将PNS与5-FU联合应用于HCTT-116细胞，发现PNS能够增强5-FU的抗肿瘤作用^[19] 。Wang 等^[20] 发现PNS 能够提高低剂量Cytoxan对黑色素瘤模型小鼠的抗肿瘤作用。这表明PNS能够增强化疗药物的化疗作用，提示PNS可以作为治疗癌症的辅助用药。总之，本研究发现PNS能够抑制K562细胞增殖，促进其凋亡，使其发生周期阻滞，从而发挥其抗肿瘤的作用，为PNS临床治疗白血病提供了一定的理论基础。