血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）是体内一种主要的促有丝分裂剂，可以刺激多种组织细胞增殖、迁移。PDGFBB属于PDGF家族，可由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、某些肿瘤细胞等多种细胞分泌，在PDGF家族成员中，仅PDGFBB能结合所有PDGF受体，使受体磷酸化，活化下游重要的信号分子，参与多种信号转导通路如Ras，PI3K，ERK，MAPK等^[1]，在动脉粥样硬化、血管再狭窄等心血管疾病的发生发展过程中起非常重要的作用。而平滑肌细胞表型转化这一概念最初在对血管平滑肌细胞（VSMC）的研究中提出来^[2]，VSMC分为收缩型（分化型）和合成型（增殖型或去分化型）两种类型，当血管受到病理损伤或体外培养的VSMC受到某种因素刺激时，VSMC可从收缩型转化为合成型并获得增殖能力，这个形态、结构和功能的改变过程即称为表型转化^[3]。我们前期研究^[4]表明，糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌（CCSM）细胞存在表型转化，CCSM细胞表型转化可以改变阴茎海绵体的正常结构和功能，与ED的发生密切相关。虽然有文献[5-6]报道PDGFBB可促进VSMC增殖、迁移及表型转化，但是在CCSM细胞表型转化和ED方面的研究尚未见报道，它是否会影响CCSM细胞增殖、迁移及表型转化还不清楚。因此本文研究PDGFBB对体外培养的CCSM细胞增殖、迁移及表型转化的影响，并初步研究其作用机制，目的在于探讨CCSM细胞型转化的调控机制。

SPF级Wistar大鼠15只（广州南方医科大学实验动物中心提供。许可证号：SCXK（粤）2011-0015）雄性，体质量200 g左右，DMEM/F12培养液（Hyclone公司），胎牛血清（BI公司），0.25%胰蛋白酶消化液（Hyclone公司），抗生素混合液（Sigma公司），重组PDGFBB（preprotech公司），CCK-8（日本同仁化学研究所），TRIzol、逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司），FITC标记的羊抗小鼠荧光二抗（碧云天），Alexa Fluor^® 555-标记的羊抗小鼠荧光二抗（abcam公司），myocardin一抗（Santa公司），α-SMA一抗（Santa公司），smoothelin一抗（abcam公司），β-actin单克隆抗体（北京锐抗生物公司）。

采用我们已经报道的改良的组织块培养法^[7]培养大鼠CCSM细胞，大鼠麻醉后在无菌条件下快速解剖，分离、切取阴茎海绵体中段，立即置入含1%青霉素及链霉素的无菌PBS液中并移入超净台，仔细剥除海绵体外周纤维脂肪层及尿道海绵体等，用无菌PBS液冲洗2~3次，将海绵体组织剪成1~2 mm小块，按0.5 cm间隔放置到25 cm²培养瓶内（预铺少量含20%血清的培养液）。翻转培养瓶，使有组织小块的一面向上，加入2.5 mL配制好的DMEM/F12完全培养液（含20%胎牛血清，100 U/mL青毒素，100 U/mL链霉素），注意勿使培养液与组织块接触。放入37 ℃、5% CO₂细胞培养箱，培养4~5 h后，轻轻翻转培养瓶，使培养液与组织块接触。3~5 d后，置于倒置显微镜下观察，当发现有少许细胞从组织块边缘游出，第2天即清除组织块，补加培养液至4 mL。此后2~3 d换液1次。原代细胞培养至80%~90%融合时，用10% DMEM/F12完全培养液传代培养并用差速贴壁法分离出较纯的CCSM细胞转移至新瓶中，置入培养箱中继续培养。

传代细胞以每孔1×10⁴个细胞密度接种到预置无菌盖玻片的24孔板中，补充培养液至1 mL，适应性生长24 h，待盖玻片上细胞密度合适，即去除培养液，用PBS液漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min；予0.25% Triton X-100穿孔15 min，PBS漂洗3次，每次5 min；再用1% BSA（胎牛血清白蛋白）封闭50 min，吸净液体；分别加入1% BSA稀释的α-SMA一抗（1:100稀释）和smoothelin一抗（1:100稀释），振荡两次，4 ℃恒温孵育过夜；用PBS漂洗4次，每次5~10 min，避光分别加入1%BSA稀释的FITC标记的羊抗小鼠荧光二抗（1:100稀释）和Alexa Fluor^® 555-标记的羊抗小鼠荧光二抗（1:100稀释），振荡2次，37 ℃恒温孵育30 min，PBS漂洗4次，每次5~10 min；用DAPI进行细胞核染色3~5 min，吸去DAPI液，用PBS液漂洗3次，每次5 min；予抗荧光衰减封片剂封片后，将载玻片和盖玻片放置于荧光倒置显微镜下拍照。

传代细胞以每孔3×10³个细胞密度接种到96孔板中，每孔加细胞悬液200 μL，适应性生长24 h，弃培养液，用PBS液漂洗1次。预设置5个浓度组，每组6个复孔，分别加入PDGFBB终浓度分别为0、2.5、5.0、12.5、25.0 ng/mL的无血清DMEM/F12培养液（0.1%BSA）200 μL，将细胞放置于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养，24 h和48 h后，每孔分别加入20 μL的CCK-8，继续培养2 h后，在多功能酶标仪中450 nm波长下检测各孔光吸收值，并筛选出最适PDGFBB作用浓度，用于后续实验。

传代细胞按每孔5×10⁵密度接种到6孔板中，每孔补充培养液至2 mL，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，直到细胞融合至基本铺满整个孔，换无血清DMEM/ F12培养液（0.1% BSA）继续培养24 h使细胞同步化，用200 μL的枪头在培养孔中直线刮除细胞，再用PBS漂洗3次，用筛选出的最适PDGFBB浓度（12.5 ng/mL）的无血清DMEM/F12培养液（0.1% BSA）处理细胞，阴性对照组加0 ng/mL的PDGFBB的无血清DMEM/F12培养液（0.1% BSA）。分别于0、12和24 h在倒置显微镜下观察细胞迁移并拍照。

为了了解PDGFBB对大鼠CCSM细胞表型的影响，用终浓度为12.5 ng/mL的PDGFBB（实验组）和0 ng/mL的PDGFBB无血清DMEM/F12培养液（0.1% BSA）（阴性对照组）分别处理CCSM细胞24 h和48 h，收集各组细胞，使用TRIzol提取总RNA，以各组总RNA为模板，用TaKaRa逆转录试剂盒按照说明书分别合成cDNA，然后以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参（引物均由上海生物工程公司合成，各引物序列见表 1），进行荧光定量PCR，其反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0 μL，正向及反向引物（10 mol/L）各0.4 μL，模板cDNA 2.0 μL，ddH₂O补足总体积至20 μL，95℃预变性30 s并按以下PCR反应程序进行40个循环：95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，PCR反应后，仪器自动进行熔解曲线分析。每个样品中目的基因相对于空白对照组样品的表达量以2^-ΔΔCt（①Ct值代表达到检测荧光阈值的循环数；②△Ct=待测样品目的基因Ct值-待测样品内参的Ct值；③△△Ct=处理后△Ct-处理前△ Ct）表示。

表 1(Table 1)

表 1 引物和序列 Table 1 Primers and sequences Primers Sequences ( 5'→3') Segment size/bp Myocardin F: CTTGCAGATGACCTCAACGA 91 R: TCACGGAAGAATCCATAGGC α-SMA F: TTCAATGTCCCTGCCATGTA 94 R: CATCTCCAGAGTCCAGCACA SMMHC F: GATGTGGTGCAGAAAGCTCA 97 R: TGAGAATCCATCGGAAAAGG GAPDH F: GCCAGCCTCGTCTCATAGACA 230 R: AGAGAAGGCAGCCCTGGTAAC

表 1 引物和序列 Table 1 Primers and sequences

为了了解PDGFBB作用CCSM细胞不同时间后，细胞中转录因子myocardin蛋白表达变化。予终浓度为12.5 ng/mL的PDGFBB分别处理细胞0、24及48 h后收集三组细胞，用预冷的PBS缓冲液漂洗3次，每皿中加入100 μL RIPA细胞裂解液（加蛋白酶抑制剂），细胞刮刀收集至无菌EP管中，冰浴裂解30 min后，4 ℃下12 000 g离心15 min。取上清液，加入上清液1/4体积的5×上样缓冲液，煮沸5 min，置于冰上冷却。制备10%分离胶和5%浓缩胶，待胶凝固后，每孔上样10~20 μL的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。电泳参数设置：75 V，30 min；120 V，2~3 h，直至溴酚蓝指示线距胶底2 cm处为止。电泳结束后，根据Marker指示条带确定目的蛋白的位置并切胶。转膜夹板制备好后放入转膜槽进行电泳，冰浴中200 mA恒流1.5~2 h。转膜结束后，将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h，4 ℃于稀释后的一抗中孵育过夜（抗体稀释液比例：myocardin 1:300，β-actin 1:8000）。TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min，二抗稀释液室温孵育1 h。TBST溶液漂洗PVDF膜3次，每次10 min，利用采用AlphaEase FC软件对western blotting显色区带的灰度值进行采集与分析，目的蛋白表达量以内参β-actin进行标准化，对比分析各实验组间蛋白表达的差异情况。

应用SPSS13.0统计软件分析，两组间差异的比较用两个独立样本t检验；多样本均数比较采用单因素方差分析，多个实验组和一个对照组的比较采用Dunnett法，组间多重比较采用LSD法。P < 0.05表示结果有统计学意义。

倒置相差显微镜下观察发现，改良组织块法培养大鼠CCSM细胞，原代第4~5 d有少数梭形细胞从组织块边缘游出逐渐形成细胞晕（图 1A），至22 d左右细胞长满覆盖培养瓶底；传代并经差速离心筛选后的细胞绝大部分呈梭形，呈方向性排列，少部分呈星形。生长密集时，梭型或长梭型的细胞相互交织呈网状，密度高时细胞排列呈束状或旋涡状，有时呈“峰-谷”样生长（图 1B）。

图 1A(Figure 1A)

图 1A 原代培养第4天少数梭形细胞从组织块边缘爬出 Figure 1A Cell outgrowth from the edge of tissue blocks on day 4 of primary culture (Phase-contrast microscope, original magnification: ×200).

图 1B(Figure 1B)

图 1B CCSM细胞呈旋涡状或“峰-谷”样生长 Figure 1B Swirling or "peak-valley" like growth pattern of CCSM cells (Phase contrast microscope, original magnification: ×100).

CCSM细胞免疫荧光结果显示（图 2），倒置荧光纤维镜下观察发现，视野内所有细胞核均呈现蓝色荧光，绝大多数细胞呈梭形，约96.5%的细胞胞质呈现绿色荧光为α-SMA，约96%细胞胞质呈现红色荧光为smoothelin阳性的细胞，两者均为阳性的细胞阳性的细胞即CCSM细胞。可见改良组织块法加差速贴壁离心法筛选细胞，可得到较纯的CCSM细胞。

图 2(Figure 2)

图 2 CCSM细胞的免疫荧光鉴定 Figure 2 Immunofluorescence identification of CCSM cells for α-SMA and smoothelin (Original magnification: × 200). A: Immunofluorescence of α-SMA protein; B: Immunofluorescence of smoothelin protein.

利用CCK-8法，分别采用终浓度为0、2.5、5.0、12.5、25.0 ng/mL的重组PDGFBB作用体外培养的大鼠CCSM细胞，24 h和48 h时用多功能酶标仪读出各孔OD值，结果（图 3）显示，在24 h和48 h时，与阴性对照组（0 ng/mL PDGFBB）相比，各不同浓度的PDGFBB均能明显刺激大鼠CCSM细胞生长和增殖（24 h和48 h时P值均为P < 0.001）。且在终浓度为12.5 ng/mL时，PDGFBB对CCSM细胞的促增殖作用最明显；并以此浓度作为PDGFBB作用CCSM细胞的最适浓度来进行后续实验。

图 3(Figure 3)

图 3 不同浓度的PDGFBB对CCSM细胞增殖活力的影响 Figure 3 Effect of PDGFBB at different concentrations on CCSM cell viability. *P < 0.001 vs control (0 ng/mL PDGFBB).

利用划痕实验，分别采用0 ng/mL PDGFBB及12.5 ng/mL PDGFBB的无血清DMEM/F12（0.1%BSA）来诱导CCSM细胞迁移，结果（图 4）显示，在12 h和24 h，与阴性对照组相比，PDGFBB能明显增强CCSM细胞的迁移能力。

图 4(Figure 4)

图 4 PDGFBB对CCSM细胞迁移的影响 Figure 4 Effect of PDGFBB on CCSM cell migration (Original magnification: ×40).

根据2^-ΔΔCt确定各目的基因的mRNA表达量，与阴性对照组比较，24 h（图 5A）和48 h（图 5B）时PDGFBB组CCSM细胞中myocardin mRNA表达分别下降45%、66%；α-SMA mRNA表达分别下降28%、50%；SMMHC mRNA表达分别下降44%、58%。可见，PDGFBB能下调CCSM细胞转录因子myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC及的表达，进而说明PDGFBB可促进CCSM细胞表型转化。根据western blotting检测结果（图 6）显示，与0 h相比，PDGFBB刺激CCSM细胞24 h时，细胞中myocardin蛋白表达减少（P < 0.001）；与0 h相比，PDGFBB刺激CCSM细胞48 h时，CCSM细胞中myocardin蛋白表达显著减少（P < 0.001）；说明在48 h内细胞中myocardin蛋白表达水平随着PDGFBB作用时间延长而逐渐降低。推断myocardin可能参与调控PDGFBB诱导的CCSM细胞表型转化。

图 5(Figure 5)

图 5 PDGFBB刺激24 h（A）和48 h（B）时对CCSM细胞表型转化的影响 Figure 5 Effect of PDGFBB on CCSM cell phenotypic modulation at 24 h (A) and 48 h (B). *P < 0.01 vs control (0 ng/mL PDGFBB).

图 6(Figure 6)

图 6 PDGFBB处理不同时间对CCSM细胞中myocardin蛋白表达的影响 Figure 6 Effect of PDGFBB on myocardin protein expression in CCSM cells at different time points. *P < 0.001 vs control (0 h).

在阴茎勃起过程中，CCSM为各种因素作用的终末组织，处于核心地位。CCSM细胞约占海绵体组织40%~52%^[8]。CCSM细胞表型转化在器质性ED发生的过程中起非常重要的作用，然而调控CCSM细胞表型转化的机制尚不清楚。

研究发现PDGFBB能促进VSMC增殖、趋化及使细胞从收缩型向合成型转化^{[5-6, 9]}。然而，PDGFBB是否对类似的CCSM细胞有相似的作用还不清楚。Aversa等^[10]研究报道，PDGFBB及PDGF受体可在CCSM细胞中表达，PDGFBB可以改变海绵体组织中平滑肌与纤维结缔组织的比例，导致阴茎海绵体纤维化和ED的发生。推断PDGFBB可能影响CCSM细胞表型并在器质性ED的发生起重要作用。

本研究首先用不同浓度的重组PDGFBB刺激体外培养的大鼠CCSM细胞，发现各浓度PDGFBB均能明显促进CCSM细胞增殖，并且筛选出PDGFBB作用CCSM细胞的最适浓度为12.5 ng/mL。细胞划痕实验证实，PDGFBB能明显趋化CCSM细胞，增强其迁移能力。虽然PDGFBB能显著促进CCSM细胞增殖、迁移，但是在器质性ED的阴茎病理标本中，未发现CCSM细胞增生，反而有显著减少，这与我们的结果不一致，考虑可能器质性病变时还有其他复杂的机制参与体内CCSM细胞的凋亡，如糖尿病时低氧诱导CCSM细胞凋亡^[11]等，因此还需要大量的体内实验进一步探索。然而病理结果发现器质性ED如糖尿病性ED的大鼠CCSM细胞外基质沉积，并出现纤维化^[12]。文献报道，VSMC表型转化可调节细胞外基质成分的变化并促进血管纤维化^[13]。同样，CCSM细胞表型发生转化，使得其合成细胞外基质的能力增加，促进海绵体纤维化^[11]，进而导致ED的发生。因此我们主要研究大鼠CCSM表型转化。为此，本实验用重组PDGFBB处理CCSM细胞24 h和48 h后，分别设置阴性对照组，用荧光定量PCR的方法分析CCSM细胞中转录因子myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC的表达情况，结果发现，在24 h和48 h时PDGFBB均能不同程度地下调CCSM细胞中myocardin、α-SMA和SMMHC的表达。说明PDGFBB可诱导CCSM细胞发生表型转化。另外，我们采用Western blotting检测PDGFBB处理CCSM细胞不同时间后，细胞中myocardin的蛋白表达变化，结果显示，在48 h内myocardin蛋白表达随PDGFBB作用时间延长而下调。Myocardin是平滑肌细胞表型调控过程中重要的调控因子，其与SRF及CArG盒结合形成三元复合物共同调节平滑肌细胞表型^[14]，并且我们前期研究^[15-16]也显示，糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体组织中myocardin蛋白表达下调，并且阴茎海绵体过表达myocardin能够逆转CCSM细胞的表型转化和改善糖尿病性ED大鼠的勃起功能。上述结果表明，myocardin可能参与调控PDGFBB诱导的CCSM细胞表型转化。

我们前期对CCSM细胞表型转化尤其是糖尿病性ED的CCSM细胞表型转化方面做了大量研究，然而对其发生表型转化的调控机制研究尚少，本研究结果表明，PDGFBB不仅能促进体外培养的CCSM细胞增殖、迁移，更重要的是，其可诱导CCSM细胞发生表型转化，可能参与糖尿病、呼吸睡眠低通气综合征等器质性ED的发生发展。Myocardin随着PDGFBB作用时间的延长而下调，说明myocardin可能参与调控PDGFBB诱导的CCSM细胞表型转化。然而器质性ED时CCSM细胞发生表型转化是由许多因素共同参与的，其具体分子机制仍不清楚；PDGFBB诱导CCSM细胞表型转化的机制亦非常复杂，涉及许多信号通路，仍需深入研究。