气道重塑是支气管哮喘的基本特征之一。哮喘气道平滑肌细胞数量增加、肥大是气道重塑的重要原因^[1]。miR-145是一种22-nt的高度保守的微小RNA（miRNA）。研究发现miR-145通过促进肿瘤细胞生长^[2]、凋亡^[3]，但其是否能影响人支气管平滑肌细胞（HASMCs）增殖与凋亡，国内外未见报道。本研究拟探讨miR-145对ASMCs的增殖、凋亡的影响以初步了解其在哮喘中的作用。

DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（PAA），CCK-8增殖试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（北京碧云天公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen），α-actin、骨桥蛋白单克隆抗体（武汉博士德），AntimiR-145（Applied Biosystems），流式细胞仪（美国BD）。

以平滑肌特异的α-actin单克隆抗体免疫荧光染色，鉴定为ASMCs。

将ASMCs细胞分为对照组和实验组，对照组不加Anti-miR-145，实验组加入不同浓度的Anti-miR-145（10、50、100 nmol/L）。转染在六孔板内，待细胞结合度约50%~70%时进行，加入不同浓度的AntimiR-145和10 μL的Lipofectamine 2000。转染后5 h换液。

转染5 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，继续37 ℃培养2 h，酶联免疫检测仪上450 nm处检测吸光度（A₄₅₀值）。具体同文献[5]。

上述细胞制成2×10⁵/mL的悬液，取0.5 mL离心，195 μL Annexin V-FITC结合液重悬，加入5 μL Annexin V-FITC混匀避光孵育15 min。离心弃上清，再次以195 μL Annexin V-FITC结合液重悬，加10 μL氯化丙啶，流式细胞仪检测。凋亡率=阳性细胞数/细胞总数。

Western blotting检测Anti-miR-145转染对ASMCs骨桥蛋白（OPN）合成的影响。同文献[6]。

采用SPSS 13.0统计分析，数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

倒置相差显微镜下，HASMCs汇合后呈典型的“峰、谷”状。α-actin免疫荧光染色见绿色荧光。

10 nmol/L和50 nmol/L anti-miR-145转染HASMC后，平均吸光度值显著高于对照组。其中10 nmol/L组为0.986±0.103，较对照组0.834±0.128显著增高（P < 0.05）；50 nmol/L组为1.101±0.089，较对照组显著增高（P < 0.01）；而100 nmol/L anti-miR-145抑制剂转染ASMC后，平均吸光度0.932±0.115与对照组比较无显著差异（P > 0.05）。

图 1(Figure 1)

图 1 培养的HASMCs形态及鉴定 Figure 1 Morphological and phenotypic identification of cultured HASMCs (Original magnification:×100). A: The typical peak and valley growth pattern of HASMCs; B: Immunofluorescence staining for α-SMA (green-fluorescence).

如图 2所示，50 nmol/L anti-miR-145组凋亡率（3.57±0.35）%较对照组（6.4±0.36）%显著降低（P < 0.01）。提示Anti-miR-145抑制HASMCs凋亡。

图 2(Figure 2)

图 2 Anti-miR-145对HASMCs凋亡的影响 Figure 2 Effect of anti-miR-145 on HASMC apoptosis. A: Control group; B: 50 nmol/L anti-miR-145 group.

如图 3所示，10 nmol/L、50 nmol/L anti-miR-145促进HASMCs骨桥蛋白合成。100 nmol/L对HASMCs骨桥蛋白合成无明显影响。

图 3(Figure 3)

图 3 不同浓度Ani-miR-145对骨桥蛋白合成的影响 Figure 3 Anti-miR-145 enhances osteopontin (OPN) synthesis in HASMCs. Upper: Western blotting results. HASMCs were stimulated with DMEM (control) and anti-miR-145 at 10, 50, and 100 nmol/L (Lanes 2, 3, and 4, respectively) for 48h. Lower: Quantitative analysis of the results (Mean±SD, n=3). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control.

miR-145是一种22-nt的高度保守miRNA，作用于c-Myc、CDK4进而抑制细胞增殖，使其停止在G1/S期^[7]，并通过Akt（P13K/Akt信号转导途径）、ERK（细胞外信号调节激酶（ERK）、EGFR（EGFR/MAPK信号通路）和NUDT1途径抑制细胞生长^[8]。且miR-145可通过抑制DEF45蛋白的表达，而诱导结肠癌细胞凋亡^[3]。已在肺组织中发现miR-145表达^[9]。Collison等^[10]发现，哮喘小鼠气道平滑肌miR-145表达上调，拮抗miR-145可减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症、气道粘液分泌、Th2细胞因子产生和气道高反应，其治疗效果可与激素媲美，提示miR-145可能在哮喘气道炎症中具有重要作用。但miR-145对哮喘气道重塑的关键细胞-ASMCs是否同样存在影响，国内外均未见相关的报道。本研究结果表明，拮抗miR-145可促进HASMCs增殖，抑制其凋亡，提示miR-145可能通过抑制平滑肌细胞增殖、促进其凋亡而参与支气管哮喘气道重塑。

Simoes等^[11]和Kohan等^[12-13]通过哮喘小鼠相继证实，与WT组比较，OPN-/-小鼠气道气道平滑肌增生面积减少、上皮下沉积的胶原蛋白含量降低。其研究尚发现重组OPN能促进支气管平滑肌细胞增殖分化。此外，有研究发现OPN可通过c-Myc^[14]、ERK^[15]通路促进细胞增殖。鉴于本研究发现Anti-miR-145可促进HASMCs增殖，我们进一步探讨了miR-145与OPN的关系。研究结果表明，Anti-miR-145促进OPN蛋白合成，提示miR-145促进HASMCs增殖可能与OPN有关。

总之，anti-miR-145可促进HASMCs增殖，抑制其凋亡，其机制可能与通过上调OPN表达有关。miR-145可能在支气管哮喘气道重塑中起重要作用。