神经胶质瘤简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。胶质瘤以男性较多见，特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤，男性明显多于女性。胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一般为数周至数月，少数可达数年。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物等因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。

胶质瘤发病原因复杂，主要可能与遗传、电离辐射和化学致癌物等有关系。而这些因素的改变驱动了胶质瘤发病相关的表达改变，异常导致癌基因的激活以及抑癌基因的失活^[1-3]，因而促进了胶质瘤发病。

ZNF217是Krupple样转录因子，属于锌指蛋白家族成员。该基因过表达已经展示在多个肿瘤中，包括乳腺癌、卵巢癌、大肠癌以及恶性胶质瘤中，重要的促进了这些肿瘤的发病过程。然而，该基因在胶质瘤的作用及机制目前研究很少，特别是迁移和侵袭方面更是没有报导。本研究通过慢病毒介导的shRNA靶向抑制ZNF217进行了这些方面的研究。

胶质瘤细胞U251保存于南方医科大学肿瘤研究所，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 ℃，5% CO₂环境下培养。磷酸化的PI3K/AKT、E-Cadherin和、N-Cadherin购买购自美国Cell Signaling Technology（CST）公司，C-MYC和内参GAPDH兔抗人多克隆抗体购自Santa-Cruz公司。

由于选用的载体为pLVTMH慢病毒表达载体系统，RNAi设计采用了Invitrogen公司提供的在线网站设计。我们根据Invitrogen公司在线RNAi设计系统，设计了ZNF217的shRNA：

sense：5'CGCGTCCCC_{GCCTGTGTCATATCAACACTTTCTCTTGAAAAGT GTTGATATGACACAGG}TTTTTGGAAAT3'；

antisense：5'CGATTTCCAAAAA_{GCCTGTGTCATATCAACACT TTTCAAGAGAAAGTGTTGATATGACACAGGC}GGGGA3'

序列引物为上海生物工程公司合成。将双链寡核苷酸进行退火形成双链，在与经内切酶ClaⅠ和MluⅠ双酶切后的pLVTHM载体进行重组。产物最后进行测序鉴定。进一步，shRNA-ZNF217与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染293FT细胞，72 h收集病毒，感染胶质瘤U251细胞。空载病毒感染的质瘤U251细胞作为对照。扩大培养的2种细胞在经流式细胞仪富集，ZNF217干扰效率被Western blot检测

Transwell小室细胞运动实验。本实验所用Transwell小室购自美国Corning公司，小室内的膜材料为聚碳酸酯（polycarbonate, PC），小室孔径为8.0 μm。将生长状态良好的培养细胞调整到浓度为1×10⁶/mL。加100 μL细胞悬液于内室，然后加500 μL含10%新生牛血清的完全培养基于下室，37 ℃培养15 h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥，用Giemsa应用染液染色5 min，用蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。重复3次。

实验用的Boyden小室购自Chemicon，该小室是利用ECMatrix^TM，即利用EHS（Engelbreth Holm-Swarm）小鼠肿瘤组织成分重新构建的人工基底膜，评价肿瘤细胞的侵袭能力，小室孔径为8.0 μm。在内室中加300 μL无血清培养基，置于培养箱中孵育1~2 h，使ECMatrix层亲水。细胞经胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL。加200 μL细胞悬液于内室，然后加500 μL完全培养基于下室，37℃培养18 h。取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，然后将小室浸入甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥，用Giemsa应用染液染色5 min，蒸馏水轻轻地冲洗数次，空气风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过ECMatrix膜的细胞数。重复3次。

于96孔板中每孔接种对数期1×10³个细胞，体积为200 μL，每组设3个复孔，同时设空白对照。在分别培养1、2、3、4、5、6和7 d后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL后37 ℃培养4 h。弃去培养基，发现有紫蓝色结晶物出现后加入150 μL DMSO。室温避光摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解。以空白孔为对照，用酶标仪490 nm波长测定各孔吸光度值（A值）。重复3次，绘制生长曲线。

胶质瘤shZNF217和其对照PLVTMH U251细胞各自接种到6孔培养板。当细胞培养48~72 h之间时收集细胞，加预冷70%乙醇固定过夜，用PI染色，流式细胞仪进行检测。

Western blot检测细胞生成以及EMT相关蛋白因子表达变化。分别收集5×106稳定整合shRNA-ZNF217慢病毒表达载体和阴性空载体的细胞。PBS漂洗细胞，在4 ℃下3000 r/min离心10 min，收集细胞，加入裂解液120 μL，冰上裂解30 min，100 ℃煮沸变性10 min，冰上复性5 min，超声粉碎30 s，12 000×g离心30 min，吸上清。BSA分析试剂测定蛋白质浓度。30 μg总蛋白质在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至NC膜。将一抗抗体与膜孵育1 h后，将二抗（1:50）与膜孵育1 h；ECL试剂盒进行化学发光检测。抗体使用浓度均为1: 500。

SPSS 13.0统计分析，P < 0.05表示有统计学意义。数据用均数±标准差表示，配对t检验用于细胞体外游走、侵袭以及增殖分析。

扩大培养的shRNA-ZNF217和空载细胞在经流式细胞仪富集后，其有效感染率都达到了90%以上。实时荧光定量PCR检测发现，ZNF217 mRNA在干扰组下降到只有对照组的25.7%。进一步，western blot检测发现，ZNF217在shZNF217细胞中表达明显下降，其有效抑制率为69.23%（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 Western blot检测U251细胞中ZNF217基因干扰前后蛋白表达情况 Figure 1 ZNF217 protein expression detected by Western blotting in U251 cells with ZNF217 knockdown.

首先，我们检测了ZNF217对胶质瘤细胞迁移能力的影响。与对照pLVTMH细胞相比，在抑制ZNF217表达后，胶质瘤U251细胞迁移能力明显减低具有明显的统计学意义（P < 0.001，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 抑制ZNF217表达后胶质瘤细胞迁移能力明显减低 Figure 2 ZNF217 knockdown reduces the migration ability of glioma cells.

进一步，我们利用boyden小室检测了ZNF217基因对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。与对照pLVTMH细胞相比，在抑制ZNF217表达后，胶质瘤U251细胞侵袭能力明显下降，具有明显的统计学意义（3 < 0.001，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 抑制ZNF217表达后胶质瘤细胞侵袭能力明显抑制 Figure 3 ZNF217 knockdown suppressed invasion of glioma cells.

与对照pLVTMH细胞相比，在抑制ZNF217表达后，胶质瘤U251细胞生长能力从第2天开始起一直到检测的第7天就明显降低，并具有明显的统计学意义（P < 0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 抑制ZNF217表达后胶质瘤细胞生长能力明显抑制 Figure 4 ZNF217 knockdown suppresses glioma cell growth.

流式细胞仪检测分析细胞发现，在稳定抑制ZNF217表达后，细胞周期主要阻滞在G1期，且S和G2期DNA含量都明显降低（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 稳定抑制ZNF217表达抑制胶质瘤细胞周期转化 Figure 5 Stable suppression of ZNF217 inhibits the transition of cell cycle.

利用慢病毒介导的shRNA抑制ZNF217表达后，胶质瘤细胞中磷酸化的PI3K/AKT活性明显降低。此外，该信号通路下游基因C-Myc和N-Cadherin表达也明显下调，而E-Cadherin表达则显著升高（图 6）。

图 6(Figure 6)

图 6 Western blot检测ZNF217基因抑制后相关基因表达 Figure 6 Western blotting for detecting the related gene expressions in glioma cells with ZNF217 knockdown.

锌指结构是由若干保守的氨基酸残基同锌离子结合，形成相对独立的“指”状四面体结构，这一结构最早由Miller于1985年在非洲爪蟾转录因子TFⅢA中发现^[10]。此后，人们陆续发现了大量含有锌指结构的蛋白质，统称为锌指蛋白。锌指蛋白在真核生物中广泛表达，参与细胞的分化、增殖和凋亡等多种重要生命过程。具有转录因子活性的锌指蛋白是锌指蛋白家族中最庞大的成员。ZNF217基因定位于人染色体20q13.2，表达产物为ZNF217蛋白，属于锌指蛋白家族成员之一^[11]，其主要在细胞核内表达，发挥转录因子作用。

近年来，越来越多的研究显示，ZNF217在肿瘤中高表达，其中包括了乳腺癌^[4-5]、卵巢癌^[6-7]、大肠癌^[8]和胶质瘤^[9]，且过表达的ZNF217促进了乳腺癌疾病临床进展和可怜的预后。以上这些研究表明，ZNF217在肿瘤中可能发挥了重要的重要。在机制研究方面，对于ZNF217来说非常的少，目前仅有几篇论文报道。Vendrell等发现，过表达的ZNF217可以调控TGF-beta1信号通路驱动乳腺癌细胞发生EMT转换，从而促使乳腺癌细胞的侵袭和转移。此外，ZNF217在乳腺癌中能与ErbB3启动子结合，促进PI3K/AKT表达^[12]。而在胶质瘤中，过表达的ZNF217能通过激活缺氧诱导因子表达，从而维持胶质瘤细胞干性^[9]。

归因于ZNF217在胶质瘤发病过程中的重要性，在这次研究中，我们主要利用慢病毒介导的shRNA探讨了ZNF217对胶质瘤细胞迁移、侵袭以及生长的分子机制。我们发现，在稳定抑制ZNF217表达后，胶质瘤细胞的迁移、侵袭以及生长能力都明显减低，且细胞周期明显阻滞在G1期，而S和G2期细胞DNA含量明显降低。以上这些结果表明ZNF217在胶质瘤中发挥了癌基因的作用。这表明ZNF217在胶质瘤中发挥了癌基因的作用。进一步，我们分析了ZNF217促进肿瘤迁移、侵袭以及生长的分子机制。E-Cadherin和N-Cadherin分别为上皮和间质细胞的标志物。E-Cadherin表达下调以及N-Cadherin表达上调表明细胞可能发生了EMT转化^[13]，因而促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭。C-Myc是一个经典的癌基因^[14]，主要促进细胞周期有G1向S期转化，因而促进细胞的生长。在本次研究中，我们发现，在抑制ZNF217表达后，C-Myc和N-Cadherin表达下调，E-Cadherin表达下调，这表明ZNF217主要通过调节这几个关键基因表达促进了胶质瘤发病过程。

PI3K/AKT是经典的癌性信号通路^[15]，其激活主要促进了肿瘤细胞中C-Myc以及EMT相关基因表达和失活。我们的结果显示，在抑制ZNF217表达后，该信号通路表达明显失活，这表明ZNF217在胶质瘤中主要激活PI3K/AKT而导致细胞生长、迁移和侵袭。

因此，抑制ZNF217表达能显著抑制PI3K/AKT信号通路，继而失活癌基因C-Myc以及调控EMT相关基因改变，因而抑制胶质瘤细胞迁移、生长和侵袭。我们的研究表明，ZNF217在胶质瘤中发挥了癌基因作用，促进了该疾病的发病过程。