肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）是引起手足口病的主要病原体，可致神经系统疾病，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、小脑脑炎、急性弛缓性瘫痪等^{[1, 2]}，导致患者终身瘫痪，甚至死亡，是继脊髓灰质炎病毒后最重要的嗜神经性肠道病毒。手足口病疫情暴发时，常有EV71感染引起手足口病重症和死亡的报道，对公共健康安全造成巨大的威胁^[3-6]。虽然人们认识到EV71的致病性受多种因素影响，但在其致病机制方面还存在不少认识上的空白。EV71感染细胞后是在核内增殖还是在核外增殖？是首先导致细胞核损伤还是细胞质损伤？如果是损伤细胞质，那么其靶标是何种细胞器？机制又如何？这些问题的回答对于揭示EV71的致病机制有重要价值，有待明确。为此我们用从手足口病死亡病例标本中分离的EV71，通过接种Vero细胞，对上述问题进行了探讨。

（1）Vero细胞：来自南方医科大学公共卫生与热带医学学院流行病学实验室；（2）EV71型病毒株：源自2008年一EV71感染手足口病死亡病例，序列号888/ GZ/CHN/2008 ^[4]。

消化Vero细胞，用DMEM完全培养基（含5%胎牛血清）调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，混匀后每孔0.1 mL，接种于96孔细胞培养板，置37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。待长满成单层后，每孔弃培养上清并用DMEM基础培养基将EV71病毒液10倍梯度依次稀释成10^-1~10^-10个浓度，每个稀释度设8孔，每孔接种0.1 mL，同时设不加病毒液的正常细胞作对照。37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育1 h，取出培养板并弃病毒液，加入维持液（含2%胎牛血清的DMEM培养基）0.1 mL继续在37 ℃、5%CO₂培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE），观察7~10 d，记录每个稀释度发生CPE的孔数。用Reed-Muench公式^[7]计算病毒液的50%细胞感染剂量（median tissue culture infective dose, TCID₅₀）。

将1×10⁵个/mL的Vero细胞接种于铺好玻片的六孔培养板中，置37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。待长满单层后，弃上清并将0.3 mL EV71病毒液接种于培养板中。培养箱中吸附1h后，弃病毒液并PBS液洗涤2遍，加维持液（含2%胎牛血清的DMEM培养基）3 mL继续在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。对照组采用培养基代替病毒液。每日在倒置显微镜下观察CPE，当75%细胞出现病变时，弃维持液，PBS洗涤2遍；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2遍。取出玻片，0.5% TritonX-100作用15 min以破膜，PBS洗涤后加正常山羊血清室温封闭30 min以抑制非特异反应。每张玻片滴加鼠源性EV71单克隆抗体（1:2000，Millipore公司，美国），室温孵育2h，另用PBS代替EV71抗体作对照。PBS洗涤后，加荧光标记山羊抗小鼠IgG（1:200，中杉金桥），暗盒中室温孵育1 h，PBS浸洗切片。滴加抗荧光淬灭封片剂（含DAPI），荧光显微镜下观察。

接种Vero细胞于25 cm²培养瓶中，待细胞生长到培养瓶面积的80%，弃上清并加入0.5 mL EV71病毒液，于37 ℃、5% CO₂培养箱吸附1h，PBS洗涤2遍以去除未吸附的病毒；加入1.5 mL维持液继续培养。当75%细胞出现病变时，用无菌刮子轻轻刮取细胞并用移液枪转移至1.5 mL的离心管中，1500 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清，加预冷PBS温和洗涤1次，同上离心处理。弃上清并沿管壁缓慢加入预冷的2.5%的戊二醛0.5 mL，4 ℃固定2 h。常规电镜制样、超薄切片（50 nm）并透射电镜观察。

在透射电镜100 000倍下，随机取10个视野，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件通过鼠标勾选每幅图像中的病毒颗粒及病毒增殖区（病毒颗粒聚集分布区域），测试病毒颗粒直径及病毒颗粒和病毒增殖区的面积；计数所有的线粒体及空泡化的线粒体并分别测试其面积^[9]。有关计算公式如下：

（1）病毒颗粒面积密度（A_AEV71）

式中，A_EV71i表示被测胞质视野中第i个EV71病毒颗粒的面积，A_PVi表示被测胞质视野中第i个病毒增殖区的面积。

式中, A_EV71表示胞质中EV71病毒颗粒的面积，r为病毒颗粒半径。

（2）空泡化线粒体面积密度（A_AVM）

式中A _VMi表示被测胞质视野中第i个空泡化线粒体的面积，A_Mi表示被测胞质视野中第i个线粒体（包括空泡化和非空泡化）的面积。

用Reed-Muench公式计算该EV71临床分离株的TCID50，结果为10^-5.81/0.1 mL，即将病毒悬液作10^5.81倍稀释后，每孔接种0.1 mL，可使50% Vero细胞孔发生病变。普通光学显微镜下观察，可见未接种EV71的Vero细胞呈梭形贴壁生长，胞质透明度好（图 1A）。EV71感染Vero细胞后，细胞变圆、皱缩，细胞间隙增大，随着感染时间的延长，病变细胞失去黏附性，脱落并漂浮于培养上清中（图 1B）。

图 1(Figure 1)

图 1 Vero细胞经EV71感染后的光镜观察 Figure 1 Microscopical observation of EV71-infected Vero cells (Original magnification: ×20). A: Normal Vero cells; B: EV71-infected cells.

免疫荧光检测显示，Vero细胞感染EV71后，EV71抗原位于细胞质中，而不是在细胞核内，提示EV71定居在感染的Vero细胞胞质中（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 Vero细胞经EV71感染后EV71抗原免疫荧光检测 Figure 2 EV71 antigen detection by immunofluorescence in EV71-infected Vero cells (Original magnification: × 20). Blue immunofluorescence signals represented the nucleus of the Vero cells, and green signals the EV71 antigens. EV71 antigens were detected in the cytoplasm of the infected cells.

EV71感染Vero细胞后，定位在细胞质并增殖，在细胞器间可见大量呈团分布、晶格状排列、大小较一致的高电子密度病毒颗粒。病毒颗粒呈球状，粒子外无突起（图 3B、C）。对比未接种EV71的Vero细胞（图 3A），EV71感染的Vero细胞胞质中出现大量空泡，线粒体肿胀、变性并明显空泡化，线粒体嵴断裂、减少，线粒体内可见散在或游离的病毒颗粒（图 3B、C、D）。病变进一步发展，则可见细胞死亡，核消失，细胞膜也消失，呈现出大量微泡结构。

图 3(Figure 3)

图 3 Vero细胞经EV71感染后的超微结构改变 Figure 3 Ultrastructural changes of EV71-infected Vero cells. A: Uninfected Vero cells. The asterisks indicate normal mitochondria with normal mitochondrial cristae and complete mitochondrial membrane (Original magnification: × 50 000). B, C: Large numbers of viral particles (arrows) in the cytoplasm of EV71-infected Vero cells. The diameter of the viral particles was 15-20 nm. Most of the mitochondria showed swelling, vacuoles and degeneration (▲). B:(×60 000), C:(×100 000). D: Viral particles (arrows) in degenerated mitochondria (▲) (× 100 000).

病毒团块中EV71的直径为14.79~20.00（16.29±1.63）nm，变异系数为10%；EV71的面积密度为（38.3±9.79）%，变异系数为26%。空泡化线粒体占所有线粒体的比例及其面积密度测试结果显示，空泡化线粒体数量占全部线粒体数量的（90.90±8.88）%，变异系数为10%；空泡化线粒体面积密度为（89.21±10.36）%，变异系数为12%。

EV71属小RNA病毒科肠道病毒属成员，是单股正链RNA病毒，为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径约为24~30 nm，由外层的衣壳和RNA核心构成^[10]。Vero细胞是非洲绿猴肾细胞，繁殖快、营养要求低，易于培养，对多种病毒敏感，为EV71培养的宿主细胞^[11]。本研究用分离自一手足口病死亡病例标本的EV71，接种于Vero细胞，观察Vero细胞感染后的形态学变化。

本研究超微结构显示EV71在Vero细胞胞质中增殖，为大小较一致的高电子密度颗粒，呈团块状分布、晶格状排列，面积密度为24.6%~53.1%，是病毒大量增殖的典型超微结构特点^[12]。细胞核内未见病毒颗粒。

本研究观察测试结果显示EV71病毒颗粒通过常规透射电镜制样，其直径表现为14.79~20 nm，与文献报道的24~30 nm不同^[13]。我们认为两者不矛盾，因为文献报道的结果为EV71非收缩状态下的大小。常规透射电镜制样过程中组织和细胞会收缩，如果我们按收缩系数为65%来计算，那么文献中报道的24~30 nm经收缩则为15.6~19.5 nm，与我们测得的数据基本吻合。这也提示EV71病毒颗粒在电镜制样过程中也会发生收缩，其收缩系数我们推测约为65%（60%~70%）。

本研究EV71感染Vero细胞后，线粒体损伤显著，明显空泡化，其内可见EV71，提示线粒体是EV71的损伤靶标，EV71可直接损伤线粒体。线粒体损伤表现为线粒体嵴崩解断裂，线粒体空泡化，空泡化线粒体的数量可占到71%~100%；面积密度由69%~100%不等。研究发现，EV71感染胶质瘤细胞，引起细胞内活性氧生成，线粒体跨膜电位下降，影响呼吸链电子传递，从而导致细胞产能障碍^[14]。EV71感染能通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）依赖的细胞凋亡途径，致线粒体内存在的凋亡相关因子释放出来^[15]，也可通过诱导线粒体Ca²⁺内流，激活钙蛋白酶，促进线粒体内凋亡相关因子转移到宿主细胞核，导致细胞凋亡的发生^[16]。但是，EV71是如何损伤线粒体的？其机制尚未认识清楚。本文根据超微结构的观察，首次提供了EV71可直接入侵宿主细胞线粒体造成线粒体结构损伤，导致细胞死亡的证据。

线粒体损伤对EV71的增殖有何影响呢？本文认为线粒体损伤后释放出的DNA，降解形成核苷酸后可为EV71增殖提供所需的基本原料，有助于EV71的增殖。

基于以上分析，我们提出EV71在Vero细胞中通过以下循环方式不断感染、增殖并损伤细胞的新机制。（1）EV71侵入Vero细胞；（2）EV71在Vero细胞胞质内增殖；（3）Vero细胞胞质内的EV71侵入线粒体并造成线粒体损伤，导致线粒体空泡化并崩解；（4）由于线粒体产能障碍，导致整个细胞功能障碍或丧失，细胞水肿并崩解死亡；此外，损伤的线粒体释放出的线粒体DNA，在胞质内降解成核苷酸，成为EV71增殖所需的基本原料，有助于EV71的进一步增殖；（5）死亡的Vero细胞崩解并释放出EV71，伺机感染新的宿主细胞或靶细胞。上述循环过程即是EV71的感染、增殖方式，也是其对Vero细胞的损伤方式及机制，本文将其概括为图 4。我们猜测EV71在Vero细胞中的上述循环、增殖过程及对Vero细胞的损伤作用和机制或许同样存在于机体组织中。

图 4(Figure 4)

图 4 EV71对Vero细胞的感染、损伤作用及其增殖循环过程 Figure 4 The process of infection, damage and proliferation of EV71 in Vero cells. a. EV71 was around the cell; b. EV71 invaded the cell; c. EV71 proliferated in the cytoplasm; d. EV71 invaded the mitochondria, leading to the degeneration; e. EV71 proliferated and the mitochondria presented vacuole; f. The infected cells progressed to disruption and released the viral particles.

虽然我们观察到EV71可感染Vero细胞并损伤其线粒体，但是EV71是如何侵入细胞的？是通过受体途径、细胞的吞噬作用还是简单弥散方式得以进入细胞？EV71又是如何侵入并损伤线粒体的？EV71除了对线粒体有直接损伤作用外，是否还具有间接损伤作用？这些问题还有待进一步研究。