急性T淋巴细胞白血病是一种来源于T淋巴细胞的恶性程度高，预后差的恶性克隆性疾病，大约占成人急性淋巴细胞白血病的25%。儿童急性淋巴细胞白血病的10%~15% ^[1]。随着新的化疗药物和方案的应用，其预后有了很大改善，但其耐药和复发仍是临床治疗面临的难题。

成人T细胞白血病/淋巴瘤（adult T-cell leukemia/ lymphoma）是由HTLV-1感染引起，但普通型急性T淋巴细胞白血病的确切病因迄今不明。我们前期研究发现，人内源性逆转录病毒HERV-K编码的Np9基因在人急性T淋巴细胞白血病中呈异常激活状态，具有促进白血病细胞增殖的作用，该结果提示抑制HERV-K Np9基因表达可能为治疗人急性T淋巴细胞白血病提供一种新的希望^[2]。因此，筛选具有抑制HERV-K Np9基因功能的药物有可能为寻找新的抗白血病药提供新的方向。

雷公藤甲素是从中草药雷公藤中提取出来的一种环氧二萜内酯成分^[3]，具有抗炎、免疫调节^[4-5]、抗肿瘤等作用^[6]。已有研究表明雷公藤甲素能够活化抑癌基因p53促进肿瘤细胞凋亡^[7]，诱导Bcl-2剪切和线粒体依赖的途径导致凋亡^[8]，并且能够下调周期相关因子cyclin D1和Bcl-x^[9]。Titov等^[10]研究发现，抑制肿瘤细胞RNA聚合酶Ⅱ转录作用是雷公藤甲素发挥抗癌作用的重要机制之一，而RNA聚合酶Ⅱ已被证实是所有已知逆转录病毒基因转录必需的^[11]。因此，我们推测雷公藤甲素可能是一种HERV-K Np9 mRNA基因转录抑制剂，通过抑制RNA聚合酶Ⅱ而抑制Np9 mRNA的表达，进而抑制其下游信号通路发挥抗肿瘤作用。本研究通过检测雷公藤甲素作用于Jurkat细胞后细胞凋亡、Np9基因转录水平及其下游信号分子c-myc，β-catenin，ERK，AKT和Notch1蛋白水平的变化，探讨雷公藤甲素诱导Jurkat细胞凋亡的可能分子机制，为人T淋巴细胞白血病的治疗提供新的科学依据。

RPMI 1640细胞培养基购于Gibco；胎牛血清购于Biological Industries；MTT粉剂购于Sigma；Np9全长上游引物：5-ATGAACCCATCGGAG ATGCAA-3，下游引物：5-ACAGAATCTCAAGGCAG AAG-3；内参β-actin上游引物：5-GGATCCGACTTCG AGCAAGAGATGGCCAC-3，下游引物：5-CAATGCC AGGGTACATGGTG-3；上述引物均由Invitrogen上海合成部合成。RNA提取试剂购于Invitrogen；逆转录酶试剂盒购于Promega；DL2000 DNA ladder、Taq polymerase购于Takara公司；琼脂糖购于生工生物工程公司，Gelred核酸凝胶染料购于美国Biotium公司，一抗：β-catenin，p-ERK，ERK，p-AKT，AKT和Notch1，c-myc购于CST；GAPDH购于康成生物；二抗：HRP偶联的抗兔、抗鼠购于康成生物；PVDF膜购于BIO-RAD；ECL购于PIERCE。AV/PI细胞凋亡试剂盒购于美国BD公司。

Jurkat细胞用含有10%胎牛血清，1%青-链霉素的RPMI 1640培养，置于37 ℃，5% CO₂，饱和湿度培养箱，实验所用细胞均处于对数期。

将细胞悬液（5×10⁴/ml）加入到96孔培养板中，每孔100 μl，培养4 h后，根据实验要求加入不同浓度的雷公藤甲素100 μl，另设空白孔（只有培养基，无细胞），不加药对照，每组6个复孔。培养72 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，反应4 h，离心吸去培养基，每孔加200 μl DMSO摇匀后酶标仪（波长570 nm）测其吸光度值（A）。利用公式测定抑制率（%）=（1-A _实验组/A _对照组）× 100%，然后用OriginPro8计算出IC₅₀。

Jurkat细胞（1×10⁵ /ml），按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度，加入雷公藤甲素处理，48 h后收集细胞，用冷的PBS洗两遍，取1×10⁶个细胞加入1 ml结合缓冲液重悬，取100 μl加入Annexin V/FITC 5 μl和PI 5 μl，混匀室温避光孵育15 min，然后加入400 μl结合缓冲液，采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

Jurkat细胞（1×10⁵/ml），按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度，加入雷公藤甲素处理，48 h后收集细胞，按Trizol说明书方法提取总RNA，以2 μg总RNA为模板逆转录成cDNA，按照Taq polymerase说明书进行半定量RT-PCR，PCR产物5 μl进行琼脂糖电泳，紫外灯下显像。用Kodak 1D 3.6软件对条带进行定量。mRNA相对含量=目的基因条带积分吸光度值/内参照β-actin，基因条带积分吸光度值。采用统计软件SPSS 19.0分析Np9转录抑制与细胞凋亡的相关性。

Jurkat细胞（1×10⁵/ml），按照0、2、4、8、16 nmol/L浓度，加入雷公藤甲素处理，48 h后收集细胞，冷PBS洗2遍，用M-PER（PIERCE）裂解液冰上裂解20 min，4 ℃ 14 000 g离心15 min，提取上清总蛋白。BCA法测蛋白浓度，取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，用含5%奶粉的TBST室温1 h。一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h，ECL显影，胶片曝光成像。

统计分析，多个样本均数的比较采用方差分析，统计软件为SPSS 19.0，数据以均数±标准差表示，P < 0.05认为差异有统计学意义。

（0.5~64）nmol/L浓度范围内的雷公藤甲素对Jurkat细胞具有增殖抑制作用，随着浓度的增高，抑制作用增强，提示雷公藤甲素对Jurkat细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖关系。0.5~64 nmol/L浓度雷公藤甲素对Jurkat细胞的增殖抑制率与阴性对照组相比均具有显著统计学差异（图 1，P < 0.05）。

图 1(Figure 1)

图 1 不同浓度雷公藤甲素对Jurkat细胞增殖抑制率的影响 Figure 1 Effects of triptolide at different concentrations on the proliferation of Jurkat cells.

0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素处理Jurkat细胞48 h后，细胞的凋亡比例分别为5.2%，16.3%，23.5%，29.9%，57.3%，随着药物浓度的上升而增加，呈剂量依赖（图 2），提示雷公藤甲素能够诱导Jurkat细胞凋亡。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度雷公藤甲素对Jurkat细胞凋亡的情况 Figure 2 Effects of triptolide at different concentrations on the apoptosis of Jurkat cells.

0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素处理Jurkat细胞48 h后，随着药物浓度的升高，Np9的mRNA表达水平降低，各组Np9 mRNA表达水平分别为1.23，0.94，0.57，0.34，0.03，加药组和对照组比较，差异具有统计学意义（P < 0.05），（图 3），说明雷公藤甲素能够下调Np9基因的mRNA表达水平，呈剂量依赖。

图 3(Figure 3)

图 3 不同浓度雷公藤甲素对Jurkat细胞Np9 mRNA转录的影响 Figure 3 Effects of triptolide at different concentrations on levels of Np9 mRNA of Jurkat cells.

由于Np9是白血病的可能的致病基因，而0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素抑制Jurkat细胞中Np9转录的同时导致Jurkat细胞凋亡，所以采用统计软件SPSS 19.0进行分析Np9转录抑制与细胞凋亡的相关性。结果显示两者之间具有显著的相关性，R2=0.907，（P < 0.05，图 4）。提示0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素抑制Np9转录可能是诱导细胞凋亡的重要机制之一。

图 4(Figure 4)

图 4 Np9 mRNA转录抑制与细胞凋亡的相关性 Figure 4 Correlation analysis between the inhibition of Np9 mRNA transcription and the cell apoptosis (R2=0.907, P < 0.05).

Western blotting结果显示，0、2、4、8、16 nmol/L雷公藤甲素处理48 h后，c-myc，β-catenin，p-ERK，p-AKT和Notch1蛋白，随着药物浓度的上升，表达水平降低越明显。提示0、2、4、8、16 nmol/L雷公藤甲能够下调Np9下游信号分子c-myc，β-catenin，p-ERK，p-AKT和Notch1的蛋白表达水平（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 不同浓度雷公藤甲素对Np9下游信号分子c-myc, β-catenin, p-ERK, ERK, p-AKT, AKT和Notch1蛋白表达的影响 Figure 5 Effects of triptolide at different concentrations on the protein levels of c-myc, β-catenin, p-ERK, ERK, p-AKT, AKT and Notch1. R2=0.9071 60.0

目前临床治疗白血病主要面临的问题仍是复发和耐药，所以寻找新的治疗靶点，开发新的治疗药物，对于提高白血病的治疗效果十分必要。白血病发病机制不明导致缺乏有效的靶向病因治疗方法，Np9蛋白特异性表达于白血病人中，而正常人中却没有，并且在急性早幼粒白血病中，Np9蛋白解除PLZF（promyelocytic leukemia zinc finger）对原癌基因c-myc的抑制，促进白血病的发生和发展^[12]。我们前期研究提示：人内源性逆转录病毒HERV-K Np9基因高表达于白血病人中，通过激活其下游c-myc，β-catenin，ERK，AKT和Notch1等多条信号通路促进白血病细胞增殖，可能是白血病发病的机制之一^[2]。因此寻找针对Np9基因的抑制剂，有希望能够从病因上抑制甚至消除白血病。已有研究提示雷公藤甲素具有抑制RNA聚合酶Ⅱ的作用^[10]，因而推测雷公藤甲素能够抑制Np9基因，从而起到靶向治疗白血病的潜在价值。目前尚无相关的研究报道。

本研究中首先通过雷公藤甲素处理人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞，结果导致Jurkat细胞增殖抑制和凋亡，呈剂量依赖，说明雷公藤甲素具有抑制和杀伤白血病细胞的作用，与Carter等^[13]报道结果相吻合。雷公藤甲素抑制和杀伤白血病细胞，其分子机制是否涉及HERV-K Np9基因的变化？因而检测雷公藤甲素处理Jurkat细胞之后，HERV-K Np9基因的表达变化。结果发现HERV-K Np9基因表达水平降低，呈剂量依赖，说明雷公藤甲素可能是Np9基因的抑制剂，与我们的推断相符。雷公藤甲素诱导白血病细胞凋亡与其下调HERV-K Np9基因表达水平之间的关系呢？采用相关性分析发现，雷公藤甲素抑制Np9基因转录与诱导细胞凋亡之间具有显著的相关性（R²=0.907）。提示雷公藤甲素抑制Np9基因转录可能是其诱导白血病细胞凋亡的分子机制之一。如前所述，HERV-K Np9基因通过激活其下游c-myc，β-catenin，ERK，AKT和Notch1等多条信号通路促进白血病细胞增殖。由于雷公藤甲素能够抑制Np9基因转录，推测雷公藤甲素也能够影响Np9激活的c-myc，β-catenin等下游信号分子的表达水平。进一步研究发现，雷公藤甲素处理细胞之后，Np9下游的信号分子c-myc、β-catenin、ERK、Akt和Notch1蛋白表达水平同时降低。与我们前期研究采用shRNA下调Np9基因所观测到的其下游的这些信号分子的表达水平降低一致^[2]。而且雷公藤甲素下调c-myc、β-catenin等信号分子，与其他的研究^[14-17]中报道一致。c-myc在急性T淋巴白血病过度激活，活化下游Notch1，阻遏抑癌基因pten ^[18]。β-catenin在急性髓系白血病中高表达，介导混合系白血病干细胞的产生和耐药^[19]。ERK促进白血病细胞生长和诱导产生耐药^[20]。Akt见于大量白血病人中，其激活可以导致恶性血液系统肿瘤^[21-22]。Notch1是调节干细胞功能的重要调节分子，阻断Notch1能够部分抑制甚至消除白血病干细胞的活性^[23]。因此，雷公藤甲素抑制Np9基因转录的同时下调这些信号分子，对于抗白血病具有重要作用。

综上所述，我们认为雷公藤甲素通过抑制逆转录病毒HERV-K Np9基因转录并同时下调其下游信号分子c-myc、β-catenin、p-ERK、p-AKT和Notch1蛋白水平，可能是诱导人急性T细胞淋巴白血病Jurkat细胞凋亡的重要分子机制之一。

雷公藤甲素抑制Np9基因转录是否具有特异性，其详细的分子机制等问题仍需要进一步的研究。