Notch信号通路为邻近细胞之间信息交流平台，激活后经二次裂解，释放Notch胞内结构域（Notch intracellular domain, NICD）进入细胞核，启动靶基因转录，发挥生物学效应^[1]。研究发现Notch不仅调节胚胎期心脏的发育和分化^[2]，而且刺激未成熟心肌细胞的增殖^[3]，促进静止期心肌细胞重新进入细胞周期，有利于损伤心肌的再生修复^[4]。最新研究发现Notch1信号通路的激活可加快心肌梗死后期心功能的恢复^[5]。因此本研究将包装高滴度Notch1胞内结构域（Notch1 intracellular domain, N1ICD）慢病毒过表达载体（N1ICD lentiviral vector, LV-N1ICD）及N1ICD慢病毒干扰载体（N1ICD-shRNA lentiviral vector, LVN1ICD-shRNA），并研究其在H9c2心肌细胞中的生物学功能，为探讨Notch1信号通路在心肌保护作用奠定研究基础。

293T细胞、H9c2心肌样细胞购于中科院上海生命科学院细胞库，DH5α化学感受态细胞购于Invitrogen。

大鼠cDNA文库来购于TAKARA；pGC-FU-EGFP-3Flag Vector、GV112 Vector、pHelper 1.0 plasmid、pHelper 2.0 plasmid购于上海吉凯基因化学技术有限公司。

Taq DNA polymerase购于北京全式金生物技术有限公司，限制性核酸内切酶（AgeⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ）购于New England Biolabs；T₄ DNA Ligase购于TaKaRa，凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购于OMEGA，In-Fusion PCR Cloning Kit购于Clontech laboratories；Lipofectamine^TM 2000购于Invitrogen，细胞裂解液购于碧云天生物技术研究所，小鼠抗Flag单克隆抗体购于anbo，小鼠抗β-Actin单克隆抗体购于Cell signaling technology；辣根过氧化物酶标记山羊小鼠IgG均购于北京中杉金桥公司，化学发光试剂盒(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate)购自美国Pierce，CCK-8试剂盒购于Solarbio。

根据GeneBank中的大鼠Notch1基因编码序列（NCBI Reference Sequence: NM_001105721），Primer Premier 5.0设计N1ICD克隆引物并插入AgeⅠ与NheⅠ酶切位点（Forward Primer: 5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGG TGCTGCTGTCCCGCAAGC-3'，Reverse Primer:5'-T CATCCTTGTAGTCGCTAGCCTTAAATGCCTCTGGAATG-3'），产物大小为2364 bp；设计N1ICD鉴定引物（Forward Primer: 5'-GTGCAGACCCAGCAGGT G-3', Reverse Primer: 5'-AGCGTA AAAGGAGCAAC ATAG-3'），产物大小为665 bp；设计LV-N1ICD Realtime PCR引物（Forward Primer: 5'-AATTCCGTGG TGTTGTCG-3'，Reverse Primer: 5'-AAGGTCCGCTG GATTGAG-3'），产物大小为123 bp；设计GV112通用引物（Forward Primer: 5'-CCTATTTCCCATGATTCC TTCATA-3', Reverse Primer: 5'-GT AATACGGTTATC CACGCG-3'），产物大小542 bp；一起交Invitrogen公司合成，规格为2OD。

针对大鼠Notch1基因，设计4对N1ICD-shRNA寡核苷酸序列（N1ICDshRNA-1: GCACAGTGCTGAGTACCAA；N1ICDshRNA-2: GCCTCTCC ACCAATACCTT；N1ICDshRNA-3: CCCACATTCCAGAGGCATT；N1ICDshRNA-4: TCTGGATGCCCGAATGCAT），分别插入AgeⅠ与EcoRⅠ酶切位点，交Invitrogen公司合成，规格为2OD。

以大鼠cDNA文库为模板，PCR法获得N1ICD，经In-Fusion PCR Cloning Kit交换入pGC-FU-EGFP-3Flag Vector，转化DH5α感受态细胞，接种于氨苄青霉素（Amp+，100 μg/ml）的LB培养基平板，次日随机挑选阳性单克隆菌落，菌落PCR鉴定转化子，送基因测序，无突变的克隆命名为pGC-FU-N1ICD-3Flag重组质粒。利用Lipofectamine^TM 2000分2组（Control组：转染pGC-FU-EGFP-3Flag Vector、Overexpression组：转染pGC-FU-N1ICD-3Flag重组载体）转染293T细胞，48 h后提总蛋白，Western-blotting检测Flag及β-Actin表达。

将4对Oligonucleotide退火形成双链，T₄ DNA Ligase连接AgeⅠ与EcoRⅠ双切酶后的双链Oligonucleotide、GVC112。将4组连接产物转化DH5α化学感受态细胞，接种于Amp+的LB培养基平板，次日随机挑选阳性单克隆菌落，使用GV112通用引物PCR鉴定阳性转化子，行基因测序，序列无误后分别命名为GVC112-N1ICD-shRNA-1、GVC112-N1ICD-shRNA-2、GVC112-N1ICD-shRNA-3、GVC112-N1ICD-shRNA-4。按Lipofectamine^TM 2000方法，分5组进行转染293T细胞，其中Control组为pGC-FU-N1ICD-3Flag+无义干扰质粒、N1ICD-shRNA-1组为pGC-FUN1ICD-3Flag + GVC112-N1ICD-shRNA-1、N1ICDshRNA-2组为pGC-FU-N1ICD-3Flag + GVC112-N1ICD-shRNA-2、N1ICD-shRNA-3组为pGC-FUN1ICD-3Flag + GVC112-N1ICD-shRNA-3、N1ICDshRNA-4组为pGC-FU-N1ICD-3Flag + GVC112-N1ICD-shRNA-4，48 h后提总蛋白，Western-blotting检测Flag及β-Actin表达。

将pGC-FU-N1ICD-3Flag/GVC112-N1ICD-shRNA 20 μg、pHelper 1.0 15 μg、pHelper 2.0 10 μg共转293T细胞，48 h后，收集上清液，浓缩纯化，获得LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA慢病毒载体，分别采用Real-time PCR及药物筛选法测定LV-N1ICD及LV-N1ICDshRNA滴度。

H9c2心肌细胞铺板，感染增强液（ENi.S）稀释病毒至20感染复数（MOI），去除半量DEME+10%FBS，加入稀释病毒，再加入5 μl/ml Ploybrene，混匀，孵育24 h后，更换DMEM+10% FBS，继续培养72 h。

H9c2心肌细胞铺96孔板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，CO₂培养箱内继续孵育1.5 h，酶标仪测定450 nm吸光度。

N1ICD经PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳可见一条约2364 bp的特异条带（图 1A），与预计结果相符。将N1ICD插入pGC-FU-EGFP-3Flag Vector获得pGCFU-N1ICD-3Flag转化子，菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳可见一条约665 bp的特异条带（图 1B），与预计结果相符。DNAMAN（Version 6.0.3.99）比对分析基因测序结果，与NlICD基因编码序列完全一致（图 1C）。将pGC-FU-N1ICD-3Flag质粒转染293T细胞，48 h后提总蛋白，Western-blotting显示Flag在Overexpression组表达，位置在89 000左右，提示pGC-FU-N1ICD-3Flag重组质粒构建成功，功能正常（图 1D）。

图 1(Figure 1)

图 1 pGC-FU-N1ICD-3Flag重组质粒构建及鉴定 Figure 1 Construction and identification of recombinant plasmid of pGC-FU-N1ICD-3Flag: A: N1ICD gel electrophoresis imaging; B: pGC-FU-N1ICD-3Flag transformant colony PCR identification; C: The pGC-FU-N1ICD-3Flag recombinant plasmid of gene sequencing; D: The normal expression of pGC-FU-N1ICD-3Flag recombinant plasmid.

GVC112-N1ICD-shRNA阳性转化子菌落PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳可见一条约586 bp的特异条带，与预计结果相符（图 2A）。DNAMAN比对分析基因测序结果，与N1ICD-shRNA基因序列完全一致（图 2B~E）。将GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒与pGCFU-N1ICD-3Flag重组质粒共转293T细胞，48 h后提总蛋白，Western-blotting显示Flag在第4、5组表达最低，约为Mock组的90%，提示GVC112-N1ICD-shRNA-2、GVC112-N1ICD-shRNA-3可有效干扰N1ICD（图 2F）。本课题选取GVC112-N1ICD-shRNA-3作为后续实验研究。

图 2(Figure 2)

图 2 GVC112-N1ICD-shRNA干扰质粒构建 Figure 2 Construction of GVC112-N1ICD-shRNA interference plasmids: A: GVC112-N1ICD-shRNA transformant colony PCR identification; B-E: GVC112-N1ICD-shRNA interference plasmid DNA sequencing; F: Screening of GVC112-N1ICD-shRNA interference plasmid.

利用Real-time PCR测定LV-N1ICD滴度，分析不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量（表 1），10^-4 μl组和Con组样品间Ct值存在2个左右差异，认为在10^-4 μl组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少1个病毒颗粒，则LV-N1ICD滴度为：1/（1.00E-04）×20=2.00E+5TU/μl=2.00E+8TU/ml。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析 Table 1 Ct value and expression analysis of different concentrations of virus infection Sample CtActin CtN1ICD CtN1ICDMean △Ct=CtN1ICDMean -CtActin △CtCon-△Ctsample Con 14.87 31.92 31.9 17.030 0.000 31.88 1 μl 14.26 17.09 17.115 2.855 14.175 17.14 10-1μl 14.47 20.49 20.475 6.005 11.025 20.46 10-2μl 14.58 23.81 23.78 9.200 7.830 23.75 10-3μl 14.6 26.7 26.62 12.020 5.010 26.54 10-4μl 14.63 28.98 28.975 14.345 2.685 28.97 10-5μl 14.83 31.38 31.345 16.515 0.515 31.31

表 1 不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析 Table 1 Ct value and expression analysis of different concentrations of virus infection

因LV-N1ICD-shRNA带有Puromycin抗性，所以采用药筛法测定滴度，即通过感染后活细胞数量来判断滴度数值，其值等于带有活细胞数除以病毒原液量。在本实验中，加入1E-5 μl病毒原液的孔中观察到5个细胞存活，说明该孔中至少有5个病毒颗粒感染了细胞，则LV-N1ICD-shRNA滴度为：5（/ 1E-5）=5E+5TU/μl=5E+ 8TU/ml。

LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA分别感染H9c2心肌细胞，利用CCK-8检测细胞活力。结果显示（图 3）：LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力（P < 0.05），LV-N1ICD-shRNA可降低心肌细胞活力（P < 0.05），可见Notch1可改善心肌细胞增殖能力。

图 3(Figure 3)

图 3 Notch1对心肌细胞活力的影响 Figure 3 Effect of Notch1 on myocardial cell viability. P < 0.05 vs LV-N1ICD; *P < 0.05 vs LV-N1ICDshRNA (n=3).

Notch信号通路无特异性激动剂，因此特异性激活Notch信号通路并非易事。利用Notch激动型抗体，虽然可以激活Notch信号通路，但特异性不佳^[6]。Gude等^[7]用50 ng/ml的HGF刺激大鼠心肌细胞，在HGF/c-Met/ Notch信号转导下间接激活Notch1，在5 min内可使Notch1及Hes1表达增加，效应可维持到6 h，但HGF仍不能直接激活Notch1。Notch信号通路抑制剂包括γ-secretase抑制剂、Notch受体及配体单克隆抑制型抗体，中药成分姜黄素等^[8]。作为γ-secretase抑制剂，DAPT可以抑制Notch蛋白向NICD分裂的关键过程，能够非特异性阻断Notch信号通路的所有亚型，同样不适合Notch1信号通路的特异性研究^[9]。因此利用基因异位表达和RNAi技术，针对特定Notch1蛋白构建相应表达载体，可达到特异性激活或抑制Notch1信号通路的作用。

Notch蛋白由胞外结构域和胞内结构域组成，胞外结构域由36个表皮生长因子样重复序列和3个半胱氨酸富集的LIN12/Notch重复序列组成，表皮生长因子样重复序列负责与Notch配体结合，LIN12/Notch预防Notch信号自身激活^[10]。NICD含1个RAM23结构域、6个锚蛋白/cdc10重复序列、2个核定位序列、1个转录激活结构域、1个C末端富集脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的PEST序列。Notch蛋白编码序列长达近7.6kb，全长难以完整克隆。由于Notch信号通路主要通过NICD发挥功能，因此对NICD的功能区进行选择性克隆，是近年Notch信号通路研究的主要手段之一^[11]。但NICD在Notch蛋白编码序列上的功能定位各家报道不一，Tezuka K等利用RT-PCR技术获得小鼠cDNA文库，在Notch1 5428-6549位点定向克隆N1ICD，经验证具有Notch1蛋白的生物学功能^[12]。由于国内外尚无大鼠N1ICD载体构建报道，因此我们选择Notch第二分裂位点（Gly1743和Val1744 ^[13]）作为N1ICD基因克隆位点，经验证该片段具有Notch1蛋白的生物学效应。

目前，用于目的基因转移的的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒载体^[14]。慢病毒载体是逆转录病毒的一个亚型，目前应用较多的来源于HIV-1的病毒载体，载体容量大，可感染非分裂期细胞，能在机体内持续表达。由于N1ICD片段较大，涉及细胞及动物实验，对病毒感染效率要求高，后续有可能需要构建N1ICD稳定表达细胞株，因此我们采用慢病毒载体系统构建N1ICD过表达及干扰载体。研究发现Notch1信号通路可刺激缺血心肌细胞增生，产生良好的心肌保护效应^[7]。国内文献报道应用Notch信号通路阻断剂DAPT能抑制原代乳鼠心肌细胞增殖，促使心肌细胞发生凋亡^[15]，我们分别用LV-N1ICD及LV-N1ICDshRNA感染H9c2心肌细胞，发现Notch信号可提高心肌细胞活力，可见LV-N1ICD及LV-N1ICD-shRNA构建成功，并具有Notch信号的生物学功能，为将来Notch1信号通路在心肌保护中的功能与机制研究奠定了实验基础。