2015, Vol. 35
近年来，随着检测技术的发展，对HBsAg的定量检测也成为现实，并迅速被临床认识及认可。研究表明，HBsAg与肝内闭合环状（cccDNA）之间具有良好相关性，定量检测HBsAg对预测抗病毒的治疗疗效有重要意义[1-2]；同时也为临床医生对HBV DNA阴性患者的诊断及治疗提供了良好的依据[3-4]。然而，HBsAg定量水平及其与HBV DNA的相关性在HBV感染不同阶段及不同病情程度中的变化尚不十分清楚。本研究通过定量检测慢性乙型肝炎（CHB）轻中度组、CHB重度组和乙型肝炎肝硬化（HBV-LC）患者HBsAg和HBV DNA的水平，并对3组以HBeAg阳性和阴性进行分组，以探讨HBsAg和HBV DNA的相关性及定量检测HBsAg的临床意义。
1 对象与方法 1.1 研究对象选择2010年7月~2011年8月我院住院的CHB患者70例（CHB轻中度组CHB-LM 46例，CHB重度组CHB-S 24例）和HBV-LC患者28例，其中男76例，女22例，年龄18~79岁，平均37.53±13.50岁。诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》 [5]，并排除甲、丙、丁、戊型病毒感染及合并酒精性、药物性、自身免疫性或代谢性肝病以及原发性肝癌。另外选取51例接受核苷（酸）类似物（NA）抗病毒治疗4.08±3.06个月的患者（CHB 40例和HBV-LC 11例），其中男44例，女7例，年龄19~67（34.47±11.26）岁；服用恩替卡韦（中美上海施贵宝制药有限公司，0.5 mg/d）33例、阿德福韦酯（天津药物研究院药业有限责任公司，10 mg/d）6例、拉米夫定（葛兰素史克中国天津分公司，100 mg/d）8例、拉米夫定（100 mg/d）+阿德福韦酯（10 mg/d）4例。本实验得到我院伦理委员会批准同意，患者签署知情同意书。
1.2 病毒学指标检测采用全自动免疫分析仪（ARCHITECT i2000SR，美国Abbott公司）检测血清HBsAg滴度、HBeAg滴度、抗HCV等，试剂盒由美国Abbott公司提供（批号：37021LF00）。HBsAg阳性参考范围为0.05~250 U/ml，高于检测上限（250 U/ml）的样本用HBsAg专用稀释液稀释500倍（先1:20稀释，后1:25稀释）后再检测。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗HAV、抗HEV、抗HDV、HDV抗原等病毒性肝炎标志物。采用实时定量荧光PCR检测仪（PE9700，美国）检测血清HBV DNA载量，试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供（批号：14040111），检测下限为1.0×103copies·ml-1。
1.3 生化指标检测采用全自动酶免分析生化仪（BeckMan LX-20，美国BeckMan公司）检测谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）、白蛋白（ALB）等生化指标，试剂由美国BeckMan公司提供。采用全自动血细胞分析仪（Coulter LH750 analyzer，美国BeckMan公司）检测白细胞（WBC）、红细胞、血红蛋白（Hgb）及血小板（PLT）计数等。
1.4 统计学处理采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，各组间采用MannWhitney U检验；相关性检验采用Spearman's秩相关分析，双侧以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CHB-LM、CHB-S及HBV-LC三组的基线特征（表 1）
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表 1 CHB-LM、CHB-S及HBV-LC三组的基线特征 Table 1 Baseline characteristics of CHB-LM, CHB-S and HBV-LC groups |
CHB-LM、CHB-S及HBV-LC三组之间性别无明显差异（χ2=24.55，P=0.926）。HBV-LC组年龄高于CHB-LM组。CHB-S组和HBV-LC组TBil及DBil水平均高于CHB-LM组；且HBV-LC高于CHB-S组，差异均有统计学意义。CHB-S组ALT水平明显高于CHBLM组和HBV-LC组，且CHB-LM组高于HBV-LC组，差异均有统计学意义。CHB-S组AST水平明显高于CHB-LM组和HBV-LC组，但CHB-LM组和HBV-LC组比较无差异。HBV-LC组WBC计数和PLT计数均低于CHB-LM和CHB-S组，而CHB-LM和CHB-S组之间比较无差异。HBV-LC组Hgb低于CHB-LM组。
2.2 HBsAg和HBVDNA定量在CHB-LM、CHB-S和HBV-LC三组之间的比较HBsAg定量（n=98）在CHB-LM组5934.67（1560.26~15660.87）U/ml、CHB-S组5034.03（939.59~10917.07）U/ml和HBV-LC组1253.22（225.18~3584.16）U/ml中逐渐下降（χ2=12.537，P=0.002）；HBVDNA定量在CHB-LM组6.716（5.478~6.863）lg copies/ml、CHB-S组5.724（4.898~6.724）lg copies/ml和HBV-LC组5.613（3.308~6.169）lg copies/ml中逐渐下降（χ2=8.381，P=0.015），差异均有统计学意义。CHB-LM组和CHB-S组HBsAg定量和HBVDNA定量值均高于HBV-LC组（P < 0.05）。但CHB-LM和CHB-S两组之间比较，两者差异均无统计学意义（Z=-0.649和0.032，P>0.05，图 1A）。
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图 1 HBsAg和HBVDNA定量在CHB-LM、CHB-S和HBV-LC中的变化 Figure 1 Changes in HBsAg titer and HBV DNA load among patients with low to moderate chronic hepatitis B (CHB-LM), severe chronic hepatitis B (CHB-S) and HBV-related liver cirrhosis (HBV-LC). A: All patients (n=98); B: HBeAg-positive patients (n=56); C: HBeAg-negative patients (n=42). |
对于HBeAg阳性患者（n=56），HBsAg定量值在CHB-LM组8923.11（3589.43~23595.69）U/ml、CHB-S组5995.43（3675.81~11810.29）U/ml和HBV-LC组2172.05（692.70~4618.57）U/ml中呈下降趋势（χ2=6.146，P=0.046）；CHB-LM组HBsAg定量高于CHB-LM组（Z=-2.247，P=0.025）。HBV DNA定量值在CHB-LM组6.740（5.538~6.866）lg copies/ml、CHB-S组6.724（5.909~6.875）lg copies/ml和HBV-LC组6.146（5.623~6.748）lg copies/ml中呈下降趋势（χ2=1.009，P=0.604）。3组间两两比较，HBVDNA定量值差异均无统计学意义（P>0.05，图 1B）。
对于HBeAg阴性患者（n=42），HBsAg定量值在HBV-LC组、CHB-S组和HBV-LC组中分别为5175.44（1434.78-7904.79）、1607.17（508.97-9947.51）和685.209（114.90-2313.77）U/ml（χ2=7.196，P=0.027），差异有统计学意义。HBVDNA定量值在CHB-LM组5.724（5.177-6.580）lg copies/ml、CHB-S组5.491（4.886-6.680）lg copies/ml和HBV-LC组4.230（3.000-4.848）lg copies/ml中逐渐下降（χ2=14.658，P=0.001），差异有统计学意义。CHB-LM组和CHB-S组HBsAg定量和HBV DNA定量值均高于HBV-LC组（P < 0.01）。但CHB-LM和CHB-S两组之间比较，差异无统计学意义（Z=-0.661和-0.443，P>0.05，图 1C）。
2.3 抗病毒治疗后HBsAg和HBVDNA定量水平的变化51例随访的CHB和HBV-LC患者，与NA抗病毒治疗前相比，治疗后HBsAg水平有所下降，差异无统计学意义（8482.26±19819.89 vs 8190.76±25819.29 U/ml；Z=-1.050，P=0.294）。而治疗后HBVDNA水平下降有统计学意义（5.721±1.084 vs 3.732±1.040；Z=-5.415，P < 0.001）。
2.4 HBsAg和HBVDNA的相关性分析HBsAg与HBVDNA定量水平（n=98）在3组中呈正相关（r=0.462，P < 0.001），在CHB-LM组（r=0.389，P=0.009）和HBV-LC组（r=0.431，P=0.022）中也呈正相关性；而在CHB-S组中无明显相关性（r=0.348，P=0.104）。
对于HBeAg阳性患者（n=56），HBsAg定量与HBVDNA定量在3组总的患者（r=0.387，P=0.004）和CHB-LM组中（r=0.405，P=0.045）呈正相关。而分别在CHB-S组（r=0.225，P=0.420）和HBV-LC组（r=0.365，P=0.180）中均无相关性。
对于HBeAg阴性患者（n=42），HBsAg定量与HBVDNA定量在3组总的患者中呈正相关（r=0.406，P=0.009）。而分别在CHB-LM组（r=0.171，P=0.485）、CHB-S组（r=0.311，P=0.453）和HBV-LC组（r=0.215，P=0.481）中均无相关性。
对于51例随访的CHB和HBV-LC患者，NAs治疗前HBsAg定量与HBVDNA定量呈正相关（r=0.469，P=0.001），而两者NAs治疗后无明显相关性（r=0.241，P=0.111）；且两者治疗前后的差值也无明显的相关性（r=0.257，P=0.085）。
2.5 HBsAg和HBV DNA定量在CHB-LM、CHB-S和HBV-LC组中与生化标指的相关性分析在所有患者中（n=98），HBsAg定量与TBil（r=-0.201，P=0.048）呈负相关，与PLT呈正相关（r=-0.351，P=0.001）；HBV DNA定量与ALT（r=0.212，P=0.038）、AST（r=0.263，P=0.010）呈正相关。CHB-LM组HBV DNA定量与AST（r=0.370，P=0.014）呈正相关。HBV-LC组HBV DNA定量与ALT（r=0.443，P=0.018）呈正相关。
HBeAg阳性患者（n=56）HBsAg定量与TBil（r=-0.270，P=0.044）、DBil（r=-0.275，P=0.041）呈负相关，与PLT呈正相关（r=0.404，P=0.002）；HBVDNA定量与以上指标均无相关性（P>0.05）。其中CHB-S组HBVDNA定量与DBil（r=0.529，P=0.043）呈正相关，HBV-LC组HBsAg定量与PLT（r=0.536，P=0.040）呈正相关；HBVDNA定量与TBil（r=-0.580，P=0.024）呈负相关，与ALT（r=0.542，P=0.037）呈正相关。
HBeAg阴性患者（n=42）HBV DNA定量与AST呈正相关（r=0.363，P=0.020）；HBsAg定量与以上指标均无相关性（P>0.05），其中CHB-LM组HBV DNA定量与AST呈正相关（r=0.592，P=0.008），CHB-S和HBV-LC组均无相关性。
在51例随访的患者中，HBsAg定量治疗前后的差值与DBil治疗前后的差值呈正相关（r=0.321，P=0.034）；HBVDNA定量治疗前后的差值与TBil（r=0.442，P=0.004）、DBil（r=0.427，P=0.005）治疗前后的差值呈正相关。
3 讨论HBsAg定量检测已具备可标准化、重复性好、低成本等特点，成为乙型肝炎管理的有效工具。本研究采用化学发光法定量检测HBsAg水平在CHB-LM组、CHB-S组和CHB-LC组的变化，结果显示HBsAg定量在3组中依次逐渐下降，且HBV-LC组HBsAg定量水平明显低于其它两组，但CHB-S组与CHB-LM组两组无统计学差异。按照HBeAg阳性和阴性分组后，上述变化趋势依然存在，但在HBeAg阴性患者中表现更为明显。
有趣的是，血清HBV DNA在CHB-LM组、CHB-S组和CHB-LC组患者中也呈逐渐下降趋势，与HBsAg定量的变化趋势一致，提示HBsAg的合成与病毒复制是一个动态的变化过程。通过相关性分析，本实验结果和多数研究结果一致[6-10]：HBsAg定量与HBVDNA定量呈显著正相关。可能的原因是由于HBV侵入机体后，机体产生特异性细胞和体液免疫应答，从而造成肝细胞损害；随着HBV感染时间的延长，累积的免疫损伤也相应加重，肝细胞破坏程度也越严重，造成的肝细胞坏死也越广泛，进而导致依赖于肝细胞的HBV复制减少。HBsAg和HBV复制一样，也是依赖于肝细胞产生，以cccDNA为模板合成并组装成完整的病毒颗粒后分泌至血液中，故肝细胞大量坏死也同样导致HBsAg的合成与分泌减少[11-12]。因此，HBsAg定量在一定程度可反映HBV复制情况。然而，HBV感染自然史的研究表明，cccDNA水平在HBV感染的各个阶段有所不同[13]；由于HBsAg和HBV DNA的合成和分泌路径不完全相同，也就造成两者在以上结果提示不同阶段的相关性存在差异。Jaroszewicz等[14]认为HBsAg与HBV DNA总体相关，而在HBV持续感染的不同时期及不同基因型中的相关性也不同。本实验结果表明，HBsAg与HBV DNA在CHB-LM、CHB-S和HBV-LC三组中总体呈显著正相关，而在CHB-S组中两者无相关性；且以HBeAg阳性和阴性分组后，两者在3组中总体相关性减弱（在HBeAg阴性患者减弱更为显著），而在各个亚组中也均未发现明显相关性。此外，本实验还发现，随着NA抗病毒治疗后HBsAg与HBV DNA定量水平的下降，两者之间的相关性消失，且两者治疗前后的差值也无相关性，提示HBeAg阴性患者体内和NA抗病毒治疗后HBsAg的合成与HBV复制之间的关联被打破，这可能与HBV基因整合到宿主基因组或一条转录后优先控制HBV复制的路径（有利于HBsAg合成与分泌）有关[16]。
HBVDNA载量下降是评价抗病毒治疗有效的指标之一，HBsAg水平下降则是机体启动免疫调节并逐渐清除HBV的表现。通过动态监测两者的变化可有效地预测抗病毒治疗疗效，制定个体化应答指导治疗（RGT）策略以指导调整抗病毒治疗方案，提高疗效。Rijckborst等[17]研究表明HBeAg阴性患者经长效干扰素（PE G-IFNα-2a）治疗12周时，若HBsAg水平下降且HBVDNA下降≥2 log，39%的患者在治疗48周时获得病毒学应答，且两者同时下降预测病毒学应答的曲线下面积（AUC）最高（达0.74）；若HBsAg未下降且HBVDNA下降 < 2 log，则没有患者（0%）在治疗结束后获得病毒学应答，建议停药或换用NA继续治疗。本研究51例接受NA抗病毒治疗（4.08±3.06）月后，13（25.5%）例患者HBsAg水平下降且HBVDNA下降≥2 log，11例（21.6%）HBsAg未下降且HBVDNA下降 < 2 log，与Seto等[15]研究结果相符。因各种原因多数患者失访，所以无法进一步研究HBsAg和HBVDNA的动态变化与治疗疗效的关系。
ALT、TBil及PLT等指标是反映肝细胞膜通透性、细胞坏死程度及肝脏代偿功能的敏感指标。患者炎症反应和纤维化的加重，HBsAg呈阶梯状下降，但HBV DNA水平无明显变化，提示HBsAg较HBV DNA水平更能反映患者的病理改变程度[18]。本实验发现，血清HBsAg和HBV DNA定量水平与ALT等指标之间存在一定的相关性，且相关性不强[12]。提示单纯依靠HBsAg和HBV DNA定量水平不能完全反映肝脏病理变化及肝脏代偿功能，肝脏组织病理活检仍然是不可替代的正确判断肝脏病变的金标准。
总之，本实验发现HBsAg定量及HBV DNA在CHB-LM、CHB-S和HBV-LC三组中均呈逐渐下降趋势，以HBeAg阳性和阴性分组后，这种趋势仍然存在。在以上3组中，HBsAg定量与HBV DNA总体相关，而在HBeAg阴性患者中相关性减弱，且在抗病毒治疗后两者的相关性消失，也不能单纯依靠HBsAg和HBV DNA定量水平判断肝脏病变。这些发现为HBV DNA呈阴性的CHB患者的诊断及治疗提供了良好的依据，对评价抗病毒药物治疗的疗效和判断预后有重要意义。
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