慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia, CML）是一类发生在造血干细胞、以髓系细胞慢性增殖为主要特征的恶性克隆性疾病，占白血病新诊断病例15%~20%，年发病率为1~1.5/10万。CML随着年龄增大，发病率增加，儿童CML不足CML病例总数5%。90%以上CML患者有费城染色体（Ph），（t 9;22）（q34; q11）染色体易位并形成BCR-ABL融合基因^[1]。现有文献报道CML与Wnt/β-catenin、JAK/STAT、PI3K/AKT/ mTOR、Hedgehog（Hh）等信号通路的异常激活密切相关^[2]。

β-Arrestin1为Arrestin蛋白家族的一员，广泛存在于机体各组织与器官中。β-Arrestin1具有多重功能的信号蛋白^[3]，其经典功能是介导七次跨膜偶联受体（GPCRs）脱敏和内吞^[4]，近年来国内外研究均发现它在肿瘤的增殖、侵袭、转移等过程中也发挥重要作用^[5]。此外，Arrestin-受体复合物能以衔接蛋白的形式作用于丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联反应，导致JNK3^[6]、ERK1/2 ^[7]和p38 ^[8]等信号激活。

我们课题组前期的研究发现，在CML中β-arrestin1表达增高^[9]，且影响其标志融合基因Bcr/Abl的H4组蛋白乙酰化，从而促进K562细胞增殖^[10]，但其影响的CML相关信号通路尚未见报道。本研究以干预β-arrestin1的CML K562稳定细胞为研究对象，探讨β-arrestin1促进K562增殖的相关信号通路。

1640培养基和胎牛血清（Gibco）；CCK-8试剂（凯基公司）；anti-β-arrestin1抗体和anti-Src抗体（Abcam）；β-actin抗体（北京中衫金桥）；JNK抗体和JNK磷酸化抗体（Cell Signaling）；JNK抑制剂SP600125和MEK抑制剂PD98059（Sigma）；Src抑制剂Saracatinib（Cayman Chemical）。

人慢性髓细胞白血病细胞株K562由重庆医科大学附属儿童医院分子中心实验室保存。前期构建特异性敲减和过表达β-arrestin1及非特异性siRNA的慢病毒颗粒后感染K562细胞，经有限稀释法挑取单克隆细胞建立K562-Ctrl，K562-siβ1和K562-β1稳定细胞。细胞培养于含10%胎牛血清及1%青链霉素1640培养基中，置于37 ℃含5% CO₂孵箱，当细胞密度长至80%左右时传代。

取对数期细胞96孔板铺板，3000/200 μl 1640全培养基每孔，铺5板，每24 h加入10 μl CCK-8试剂混匀37 ℃ 5% CO₂孵育3 h后，检测450 nm光密度（D_{450 nm}），连续监测5 d。每种细胞每次设两复孔。

每日于上述实验加入CCK-8试剂前取10 μl混匀细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。取1滴混合液滴入改良牛鲍氏计数板，3 min内分别计数四个大方格内的活细胞及死细胞数，按照公式计算：细胞数/ml=4个大方格活细胞总数/ 4×10⁴×稀释倍数；细胞存活率（%）=活细胞总数（/活细胞+死细胞总数）×100%。

离心收集3×10⁶细胞，PBS洗涤1次，加入200 μl RIPA裂解液，冰上裂解30 min，每间隔5 min震荡混匀1次。4 ℃，12 000 r/min离心20 min，保留上清。用BCA法检测蛋白浓度，随后按照4:1比例在蛋白液中加入5×上样缓冲液后煮沸5 min，取20 μg蛋白电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（β-arrestin1，总JNK，p-JNK，β-actin），4 ℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育l h，TBST充分洗涤后，用增强化学发光系统（ECL）检测膜上信号。

提取细胞蛋白方法同前。每500 μl总蛋白中加入2 μg anti-β-arr1或anti-Src抗体，4 ℃缓慢摇动，抗原抗体混合过夜，准备蛋白A/G琼脂糖珠，用PBS洗涤珠子3次，3000 r/min 2 min/次，每500 μl蛋白中加入30 μl珠子，4 ℃缓慢摇动抗原抗体混合物4 h。将抗原抗体复合物3000 r/min离心3 min，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，弃上清，用预冷PBS洗3次，吸尽上清，加入50 μl 1×上样缓冲液将琼脂糖-抗原抗体复合物重悬与混匀。将样本煮5 min后离心，上清PAGE电泳与Western Blot。以IgG作为两蛋白分子结合的阴性对照。

将细胞分为两组，其中一组加入Saracatinib 5 μmol/L，另外一组为空白对照对照加入等体积DMSO，培养24 h后收集细胞提取蛋白做Co-IP。

将K562-Ctrl细胞10%完全培养基替换为0.5%培养基，37 ℃含5% CO₂培养箱中静置培养24 h。将细胞分为3组，参考文献使用浓度^[11-12]两组中分别加入SP600125 10 μmol/L及PD98059 50 μmol/L，另外一组为空白对照加入等体积DMSO，培养24 h后收集细胞提取蛋白质做Western blot。

取对数期K562-Ctrl细胞96孔板铺板，同上设3组铺5板，检测细胞增殖情况，方法同1.3。

实验结果采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间两两比较，方差齐性采用单因素方差分析，方差不齐时采用秩和分析，P < 0.05时认为有统计学差异。

用CCK-8实验连续监测5 d K562-Ctrl，K562-siβ1和K562-β1的D₄₅₀值，结果显示K562-siβ1细胞中D450值从第1天到第5天显著低于K562-Ctrl细胞，而K562-β1从第1天到第5天D₄₅₀值显著高于K562-Ctrl细胞。细胞计数显示K562-siβ1细胞较K562-Ctrl细胞存活率增加，而K562-Ctrl细胞又较K562-β1细胞存活率高（P < 0.05，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 β-arrestin1促进CML K562细胞增殖 Figure 1 β-arrestin1 promotes the cell proliferation of K562 cells. A: Proliferation of different K562 cell lines assessed with CCK8 assay; B: Viable cell number of different K562 cell lines; C: Viability of different K562 cells at 48 h. *P < 0.05, **P < 0.01. K562-siβ1 vs K562-Ctrl, *P < 0.05; K562-β1 vs K562-Ctrl, **P < 0.05.

Western Blot结果显示，在β-Arrestin1干预K562细胞中总JNK表达不受影响，但磷酸化JNK（p-JNK）表达却与β-Arrestin1表达成正相关（图 2A）。为进一步探寻K562细胞增殖与JNK通路的关系，选用了JNK选择性抑制剂SP600125及MEK抑制剂PD98059，Western Blot显示SP600125能够特异地抑制JNK磷酸化，PD98059可作为阴性对照（图 2B）。

图 2(Figure 2)

图 2 β-arrestin1促进JNK磷酸化 Figure 2 β-arrestin1 promotes JNK activation. A: We stern blot results for β-arrestin1, JNK and p-JNK in different K562 cells. B: Western blot results for JNK and p-JNK after treatment with PD98059 and SP600125.

Co-IP实验结果显示在K562细胞中，β-Arrestin1能够与Src结合（图 3A）。加入Src抑制剂Saracatinib，结果显示β-Arrestin1与Src结合减少（图 3B）。Western Blot结果显示，加入Src抑制剂后，p-JNK表达减少，β-Arrestin1无明显变化（图 3C）。

图 3(Figure 3)

图 3 Src参与β-arrestin1诱导的JNK磷酸化 Figure 3 Src is involved in β-arrestin1-induced JNK phosphorylation. A: Co-IP results for β-arrestin1 and Src in K562 cells; B: Co-IP results for β-arrestin1 and Src after treatment with Src inhibitor Saracatinib; C: Western blot results for β-arrestin1, JNK and p-JNK after treatment with inhibitor Saracatinib.

通过检测SP600125与PD98059处理后的K562细胞增殖情况，发现PD98059处理后的细胞增殖能力与生存率没有明显的改变，而SP600125处理后的细胞增殖能力与生存率明显下降（图 4，P < 0.05）。

图 4(Figure 4)

图 4 JNK抑制剂SP600125特异下调K562细胞增殖 Figure 4 SP600125 specifically suppresses proliferation in K562 cells. A: CCK8 assay of K562 cells treated with PD98059, SP600125, and DMSO; B: Viability of K562 cells treated with PD98059 and SP600125 for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01.

β-arrestins是一类在β肾上腺素受体激酶（βARK）提纯过程中发现^[13]的重要支架蛋白^[14]和信号调控因子^[15]。Arrestins蛋白广泛存在于细胞内，且对绝大多数受G蛋白偶联受体（GPCR）调控的细胞信号通路起重要作用^[16-17]。本研究利用β-arrestin1慢病毒载体构建的CML稳定K562细胞为研究对象，细胞增殖实验结果提示β-arrestin1能明显促进K562细胞增殖，与前期研究发现结果一致。

肿瘤的发生是多因素、多机制参与的结果, 其过程涉及到一系列信号传导分子的改变。随着各信号通路的作用被深入地研究，人们对肿瘤的认知愈加深入进而发现新的药物治疗靶点。细胞增殖是肿瘤形成的重要过程之一，可受多种信号通路调节。我们在检测β-arrstin1对细胞增殖相关通路激活的影响时发现，β-arrstin1特异促进JNK信号通路激活，在应用JNK选择性抑制剂SP600125后发现，JNK信号通路的激活参与K562细胞增殖。

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK），是哺乳类细胞中MAPK的一亚类，在细胞发育、凋亡、生长及免疫应答等多细胞生物过程中发挥重要作用^[18]。JNK/SAPK信号通路可被应激刺激、细胞因子、表皮生长因子及G蛋白偶联受体激活^[19]。Src蛋白是Src家族激酶的成员之一，研究表明，在氧化应激，尤其在有ROS参与的应激过程中，Src可能是JNK信号通路途径的重要因子^[20-21]。同时在功能结构域上，β-arrestin的N-端包含Src-SH3结合位点^[22]，C-端包含JNK3结合位点，调控GPCR信号通路和MAPK信号通路。其中部分MAPK信号通路中信号的传递涉及β-arrestin依赖型Src募集^[23-24]，Co-IP实验证明在K562细胞中β-arrstin1可与Src结合。以上结果提示，β-arrestin1可能通过招募Src进而促进JNK信号通路的激活。在应用Src抑制剂Saracatinib后我们发现β-arrstin1与Src结合以及p-JNK表达减少，而β-arrstin1表达无明显变化。实验结果表明Src确实参与了β-arrstin1诱导的JNK磷酸化。

综上所述，本文发现在CML细胞中β-arrestin1通过结合Src促进JNK信号通路的激活，进而促进CML K562细胞增殖，但其确切的机制有待进一步研究。本文中β-arrestin1对JNK信号通路的作用，为发现CML新的药物治疗靶点奠定了理论基础。