T2DM患者在疾病早期就已存在胰岛β细胞功能受损，第一相胰岛素分泌障碍是其最早表现。改善胰岛素第一时相分泌可更好控制餐后血糖，减轻血糖波动，保护胰岛β细胞功能，减少糖尿病并发症的发生^[1-2]。近年研究证实长期AT1R阻滞剂在体干预能减轻胰岛内氧化应激水平，增加胰岛内微血管数量和局部血流量，升高氧分压，从而改善第一相胰岛素分泌^[3-4]。我们前期研究发现坎地沙坦治疗减轻了胰岛β细胞含量的丢失，较大程度地改善了db/db糖尿病小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素分泌，但无法确定这些保护作用是源于胰岛局部RAS阻断还是全身RAS阻断^[5]。本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术抑制胰岛局部AT1R表达，观察其对第一相胰岛素分泌的影响，并探讨可能的潜在机制。

10只8周龄清洁级雌性C57BL/KsJ-db/db糖尿病小鼠及5只同周龄同窝出生的C57BL/KsJ-db/m非糖尿病小鼠（合格证号SCXX（苏）2007-0012）。总RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒、PCR引物合成（美国Invitrogen公司）。pSilencer 2.0载体购于美国Ambion公司。重组缺陷型腺病毒质粒pAdEasy-1系统、穿梭载体pAdTrack、BJ5183-AD-1感受态细菌、大肠杆菌Ecoli DH5a、空载腺病毒（Ad-siControl）以及包装细胞购于中科院上海细胞研究所。真核表达质粒pGCsi-U6-shRNA-ATIR由上海吉凯生物公司定制合成。小鼠抗AT1R抗体、GLUT-2抗体、GCK抗体、小鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶耦联山羊抗小鼠IgG抗体（美国Santa Cruz公司）。小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Morinaga, Yokohama, 日本）。

将db/db和db/m小鼠依次苯巴比妥麻醉后夹闭胆总管十二指肠乳头开口，体视显微镜下行胆总管穿刺后注射1 mg/ml浓度的Ⅳ型胶原酶2 ml，逆行进入胰管使胰腺膨大后迅速分离胰腺，将胰腺置于含Ⅳ型胶原酶1 mg/ml的Hank's平衡液中消化40 min，去除胶原成份后多次振荡洗涤，显微镜下成功分离胰岛，镜下手检胰岛，每孔50个胰岛，每组所获得胰岛至少5孔，置于装有Hank's平衡液24孔板中于37 ℃、5% CO₂恒温箱孵育备用。

用TRIzol试剂抽提两组胰岛细胞总RNA，参照逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA。AT1R上游引物5'-AGCTACAACA AGGCAAGG-3'，下游引物3'-TAGAAGGCACAGTC GAGG-5'；内参基因β-actin上游引物5'-TGTTGTCCC TGTATGCCTCTG行GTC-3'，下游引物3'-ATGTCAC GCACGATTTCCCTCTCA-5'。扩增条件：94°C预变性10 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40个循环，72 ℃ 7 min。取PCR产物于2%琼脂糖行凝胶电泳，用BIORAD Flour-S MuiltiImager凝胶成像仪扫描并保存，并用凝胶成像分析系统测定灰度值，结果以AT1R条带密度占β-actin条带密度的百分率表示。

INS-1细胞培养于RPMI 1640培养基中，加入10%（w/v）胎牛血清（GIBCO, Grand Island, NY）、11.1mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠以及50 μmmol/L β-巯基乙醇，5% CO₂/95%空气的37 ℃孵箱中培养，并每隔1~2 d换1次培养液，每周按1：3传代。在转染前两天将细胞接种入75 cm²无菌细胞培养瓶中，细胞浓度为每瓶4×10⁶个，当培养瓶中的细胞60%~70%汇合时进行转染。

根据GenBank中小鼠AT1R基因（基因序列号：NM-030985）的核苷酸序列，按照美国Ambion公司的网上设计软件设计产生3对shRNA序列，同时设计一对不针对靶基因对照序列siControl。从5'-3'末端，整个shRNA序列为BamHⅠ酶切位点、19 nt正义序列、9 nt loop接头序列、19 nt反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子（TTT TTT）和HindⅢ酶切位点。分别合成并纯化每对编码shRNA及siControl的DNA模板单链，退火形成双链DNA，用T4 DNA连接酶分别连接至pSilencer 2.0载体，利用阳离子脂质体转染至INS-1细胞，每5 μg DNA转染6× 10⁶个细胞。转染3 d后，检测INS-1细胞RNA和蛋白表达。最后选定的siAT1R针对的靶基因序列的5'末端相对于起始密码子对应于小鼠AT1R核苷酸540（GCGTCTTTCTTCTCAATCT）。

由生物公司合成针对小鼠AT1R mRNA的特异性siRNA真核表达质粒psiRNAAT1R；双酶切得到siRNA-AT1R表达片段；插入穿梭载体pAdTrack上，获得转移质粒pAdTrack-siRNAAT1R；后者经线性化后，转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组；PacⅠ酶切鉴定，筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasysiRNA-AT1R；酶切线性化后转染293细胞包装成重组病毒Ad-siAT1R，荧光显微镜观察绿色荧光表达，行PCR鉴定。通过反复感染扩增病毒，采用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒。以同样方法扩增空载病毒Ad-siControl至相当量，并纯化。获得约3.6×10⁹ pfu/ml滴度的重组腺病毒Ad-siAT1R和2.9×10⁹ pfu/ml滴度的空载病毒Ad-siControl。

db/db小鼠胰岛过夜培养24 h后分为3组处理：（1）Ad-siAT1R感染组：按MOI为100（每个胰岛按含2000个细胞计算），将Ad-siAT1R病毒液加入胰岛细胞，隔30 min轻轻晃动，共计20 h；（2）Ad-siControl感染组：按照前述方法，用Ad-siControl病毒液感染胰岛细胞；（3）空白对照组：同等条件下培养未行任何干预处理的胰岛细胞。将病毒液从胰岛细胞移除后，继续培养72 h，每24 h换1次培养液。检测各组葡萄糖刺激的胰岛素分泌（Glucose-stimulated insulin secretion, GSIS）水平，随后收集各组胰岛，检测各组AT1R，GLUT-2，以及GCK的表达。

将离体胰岛灌流系统置于37 ℃水浴，并将微量泵输注系统与其连接。将预先配置好的含2.8 mmoL/L葡萄糖的KRB溶液（129 mmol/L NaCl，5 mmol/L NaHCO₃，4.8 mmol/L KCl，1.2 mmol/L KH2PO4，1.2 mmol/L MgSO₄，0.2% BSA，10 mmol/L Hepes，2.5 mmoL/L CaCl₂，2.8 mmol/L葡萄糖，pH 7.4）充填至整个管道系统，在层析柱中加入100 μl预先配置好的葡聚糖凝胶，静置5 min，然后将每组50个胰岛转移至层析柱，静置5 min，再加入100 μl葡聚糖凝胶，盖紧硅胶塞密闭胰岛舱，然后将胰岛舱包括整个管道系统全部浸入37 ℃水浴。连接微量泵，开始2.8 mmol/L KRB 0.5 ml/h速度灌流l h，后换为16.7 mmol/L KRB l ml/h。以开始16.7 mmol/L KRB灌流为0时间点，在灌流前30、20、10 min和灌流后0、20、40、60、80、100 s以及2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30 min时收集灌流出的液体，-80 ℃保存，胰岛素测定使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒，胰高血糖素测定使用小鼠胰高血糖素ELISA试剂盒，根据测得的浓度绘制其动态分泌曲线。

按公司说明操作步骤抽提各组细胞蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度。取50 μg蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至NC膜，BSA室温封闭1 h，TBST溶液洗膜3次，每次5 min，用到的抗体主要有小鼠抗AT1R抗体、抗GCK抗体及抗GLUT-2抗体，4℃抗孵育过夜，同前法洗膜3次，室温下相应加入辣根过氧化物酶耦联山羊抗小鼠IgG抗体（1：2000）孵育2 h。用增强化学发光法显色，X片曝光显影，同时用同样方法对上述样品用抗鼠的β-actin单克隆抗体免疫杂交与显色作为内参对照，凝胶成像分析系统摄像分析。

所有数值均表示为均数±标准差。所有统计分析均使SPSS 11.0软件。组间比较采用独立t检验或单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

与db/m小鼠相比，db/db小鼠胰岛AT1R mRNA及蛋白的表达水平升高2倍左右，差异有统计学意义（P < 0.05，图 1）；而GLUT-2和GCK表达水平分别下降65.8%和62.7%（图 2），差异均有统计学意义（P < 0.05），提示db/db小鼠AT1R存在过度表达，而GLUT-2和GCK表达明显受损。

图 1(Figure 1)

图 1 db/m小鼠和db/db小鼠胰岛AT1R的表达 Figure 1 Expression levels of AT1R mRNA (A) and protein (B) in islets of db/m mice and db/db mice. *P < 0.05 vs db/m group.

图 2(Figure 2)

图 2 AT1R基因沉默对AT1R表达的影响 Figure 2 Effects of AT1R silencing on AT1R expression. A: AT1R mRNA expression in islets of db/db mice transfected with Ad-si AT1R, Ad-siControl, or Mock (*P < 0.05 vs Ad-siControl); B: Western blotting result of AT1R protein; C: AT1R protein expression in islets of db/db mice transfected with Ad-si AT1R, Ad-siControl, or Mock (*P < 0.05 vs Ad-siControl).

腺病毒感染后，Ad-siControl组和空白对照组之间AT1R的表达差异无统计学意义。Ad-siAT1R组AT1R mRNA表达水平较Ad-siControl组下降75%，蛋白表达水平下降65%，差异有统计学意义（P < 0.05），表明RNA特异性干扰成功抑制了胰岛局部AT1R表达（图 3）。与此同时，Ad-siAT1R组GLUT-2和GCK表达水平较Ad-siControl组分别升高190%和121%（均P < 0.05），提示db/db小鼠胰岛AT1R表达水平下调后，胰岛β细胞的GLUT-2和GCK表达明显升高（图 4）。

图 3(Figure 3)

图 3 db/m小鼠和db/db小鼠离体胰岛GLUT-2和GCK的表达 Figure 3 Expression of GLUT-2 and GCK protein in islets of db/m mice and db/db mice. *P < 0.05 vs db/m group. A: Western blotting; B: GLUT-2 and GCK protein expression in islets of db/ db mice and db/db mice (*P < 0.05 vs db/m group).

图 4(Figure 4)

图 4 AT1R基因沉默对GLUT-2和GCK表达的影响 Figure 4 Effects of AT1R silencing on GLUT-2 and GCK expression. A: Western blotting; B: GLUT-2 and GCK protein expression in islets of db/db mice transfected with Ad-siAT1R, Ad-siControl, or Mock (*P < 0.05 vs Ad-siControl group).

低糖灌流时，各组小鼠体外胰岛的胰岛素分泌水平无明显差异。高糖刺激后，空白对照组和Ad-siControl组的胰岛素分泌水平均出现一定程度升高，最高峰值90 mU/L左右，仅达到基础水平1.8倍。而Ad-siAT1R组的胰岛素分泌在给予16.7 mmol/L葡萄糖后1~2 min即达到最高峰值140 mU/L，为基础水平的2.8倍，与Ad-siControl组相比差异有统计学意义（均P < 0.05），表明RNA干扰特异性抑制胰岛局部AT1R表达后，db/db小鼠胰岛的第一相胰岛素分泌显著改善（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 各组体外胰岛的胰岛素分泌曲线 Figure 5 Insulin secretion curve of the islets in different groups. *P < 0.05 vs Ad-siControl group.

近年研究发现胰岛局部存在独立的RAS系统，血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ）AT1和AT2受体、血管紧张素转化酶、血管紧张素原均在小鼠胰岛中表达，实时RT-PCR、western blot和二重荧光染色更证实AT1R特定地在胰岛β细胞表达^[6]。高血糖可以剂量依赖的方式上调胰岛RAS系统各组分表达，亦有动物实验结果证实糖尿病小鼠胰岛细胞AT1R表达水平明显升高^[7-8]。本次实验结果与此一致，db/db小鼠胰岛AT1R mRNA及蛋白的表达水平显著升高，约为db/m小鼠的3倍左右。

胰岛β细胞AT1R表达对胰岛功能可能有重要影响。AT1R阻滞剂替米沙坦长期干预治疗可下调高质饮食下胰岛炎症因子IL-1β表达，降低转录因子NF-KB百分比，降低解偶联蛋白-2（UCP-2）诱导的氧化应激，减轻内质网应激，最终减缓β细胞凋亡进而改善胰岛素分泌^[9]。洛沙坦可减轻AT1R诱导的磷脂酶C-三磷酸肌醇-Ca²⁺信号通路对β细胞胰岛素分泌的损伤^[10]。我们前期研究亦发现AT1R阻滞剂治疗能够改善胰岛局部血供，减轻胰岛内氧化应激，增加胰岛细胞数量并改善胰岛素第一相分泌^{[5, 11]}。以上研究结果显示全身RAS阻断可不同程度保护胰岛分泌功能，但胰岛局部AT1R的表达对胰岛分泌功能有无直接调节作用尚不清楚。鉴于此，我们采用RNA干扰技术抑制离体db/db小鼠胰岛β细胞特异性AT1R表达，观察β细胞AT1R阻断后胰岛分泌功能有无变化。实验结果显示，腺病毒感染后Ad-siAT1R组AT1R表达水平显著降低，与此同时，第一相胰岛素分泌明显改善，峰值升高至140 mU/L，为基础水平的2.8倍，提示β细胞高表达的AT1R可直接损害胰岛素分泌功能。

但AT1R抑制β细胞胰岛素分泌的机制尚不清楚。有研究发现，AT II诱导的氧化应激可降低PI3K的活性，抑制其下游信号如AKT2介导的GLUTs的转运以及其他葡萄糖感受器的表达，减少胰岛素分泌^[12]。GLUT2和GCK是β细胞最重要的葡萄糖感受器。血糖升高超过正常范围时GLUT2将葡萄糖转运至胰岛β细胞中，继而由GCK磷酸化进入糖酵解及氧化过程，结果使ATP/ADP的比值增加，细胞内K⁺通道关闭，细胞膜去极化，Ca²⁺通道开放，细胞内Ca²⁺浓度增加，存储胰岛素的囊泡与质膜融合，胰岛素释放至胞外^[13]。胰岛β细胞GLUT2、GCK表达水平与胰岛分泌功能密切相关，GCK表达缺陷的β细胞需要更高的血糖浓度刺激才能启动胰岛素分泌，恢复GCK表达后可逆转这一现象，上调胰岛β细胞GLUT2表达水平亦可显著改善β细胞胰岛素分泌功能^[14-15]。为此我们观察了腺病毒感染前后胰岛细胞GLUT-2及GCK表达变化情况。结果显示，抑制胰岛β细胞AT1R表达后，GLUT-2及GCK表达水平明显升高，同时伴有第一相胰岛素分泌显著改善。因此我们推测，糖尿病状态下胰岛局部高浓度的AngⅡ与β细胞过度表达的AT1R受体结合后，可通过降低GLUT-2及GCK表达水平，削弱胰岛β细胞第一相胰岛素分泌。

综上所述，本研究证实胰岛β细胞表达的AT1R与其胰岛素分泌功能密切相关，阻断β细胞AT1R可升高GLUT2和GCK的表达水平，显著改善胰岛素第一相分泌，这可能是AT1R拮抗剂改善胰岛分泌功能的机制之一。