树突状细胞(dendritic cell, DC)是能力最强的抗原提呈细胞(antigen presentation cell, APC)。DC特异的结合细胞间黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)属于C型凝集素家族成员, 为Ⅱ型跨膜蛋白, 由胞浆区、跨膜区、颈区和胞外区构成, 其天然配体是细胞或病原体表面的甘露糖等结构。DC-SIGN是一种天然免疫模式识别分子(pattern-recognition receptors, PRR), 主要分布在DC膜表面^[1-2]。借助PRR, DC可识别病原体表达的高度保守的分子结构即病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMP), 在DC诱导的免疫应答中起着非常重要的作用^[3-4]。2001年, Mummidi等^[5]发现细胞内存在多种无跨膜区和胞浆区的短截DC-SIGN mRNA剪切体, 并认为其编码可溶性DC-SIGN (soluble DC-SIGN, sDC-SIGN)。2011年, Plazolles等^[6]采用在DC培养上清、人血清和类风湿关节炎病人关节液中检测到sDC-SIGN, 发现人体液中sDC-SIGN含量与疾病相关。本实验室从健康产妇胎盘中提取了RNA, 克隆了人DC-SIGN cDNA, 表达了融合蛋白sDC-SIGN-GST^[7], 并对其功能进行了研究, 发现sDC-SIGN可抑制Con A或anti-CD3/CD28活化T细胞的CD69表达、细胞增殖及细胞因子的分泌^[8]。为更好地研究sDC-SIGN的作用, 我们又优化表达了无标签蛋白的sDC-SIGN^[9]。有研究发现未成熟DC (immmature DC, imDC)可吞噬金黄色葡萄球菌(金葡菌)^[10], 且DC-SIGN胞外段-IgG Fc嵌合蛋白能结合幽门螺杆菌、结核杆菌的裂菌产物及血吸虫提取物^[11]。因此, 本实验就sDC-SIGN对imDC吞噬金葡菌的影响及其机制进行了初步研究。

重组质粒pET-17b-sDC-SIGN由本室构建^[7]并保存; IL-4、GM-CSF购自Sigma; 抗人DC-SIGN抗体(DCN46)购自美国BD Biosciences Pharmingen; 1C6、4H3为本室制备的抗sDC-SIGN单克隆抗体; E.coli BL21(DE3)表达菌为本室保存; HRP-羊抗鼠IgG抗体购自博奥森公司; CFSE购自Invitrogen; LTA购自Sigma; 金葡菌菌株43300由本室保存。

将重组表达质粒pET-17b-sDC-SIGN转入BL21 (DE3)感受态细胞中, 将菌液均匀涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂板上, 倒置, 放入37℃培养箱中, 反应12~16 h, 等到菌落长出来后, 挑取单个菌落, 接种于含同样浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中, 37℃震摇(250 r/min)培养过夜。按1:100转种于同样培养基中, 37℃震摇培养约2~3 h, 至A600 nm为1.0~1.2时, 加入IPTG (终浓度1 mmol/L), 37℃震摇培养3 h。收集细菌并裂菌处理, SDS-PAGE鉴定。将收集的包涵体沉淀用4℃预冷的2 mol/L尿素约25 ml洗涤2次后, 每克菌约用6 ml 8 mol/L尿素溶解, 以pH8.0预冷PBS进行梯度透析复性后, 用1C6-sepharose 4B柱进行亲和层析纯化, 以Western-Blot鉴定纯化产物。

细菌常规培养至对数期, 6000 r/min离心10 min, 弃上清, 用PBS洗涤2次; 将细菌调整成为1×10⁹ CFU/ml, 加入CFSE 1.5 μg/ml, 37℃避光震摇反应20 min; 用PBS洗涤2次, 6000 r/min离心10 min, 弃上清, 以PBS重悬, 4℃避光保存备用。

采用密度梯度离心和免疫磁珠负选法分离纯化外周血CD14⁺单核细胞, 用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI 1640培养基培养, 加入GM-CSF和IL-4至终浓度各40 ng/ml, 培养5 d收集细胞即为imDC。将imDC加入反应孔, 2×10⁵/孔, 按20:1比例加入CFSE-细菌, 然后每孔分别加入sDC-SIGN 0 μg、0.2 μg, 37℃轻摇反应1 h; FACS洗液洗涤3次, 加入PE-anti-CD11c抗体, 4℃反应30 min; FACS洗液洗涤2次后, 上机(FACScalibur)分析。

常规培养细菌至对数期, 6000 r/min离心10 min, 弃上清, 以PBS洗涤2次, 将细菌调整为5×10⁷ CFU/ml; 加入酶联板孔中, 100 μl/孔, 室温放置18 h; TBS-T洗板5次, 加入含1% BSA的TBS-T封闭, 300 μl/孔, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入含10 mmol/L Ca²⁺稀释的sDC-SIGN, 浓度(μg/ml)分别为40、20、10、5和2.5, 室温反应2 h; TBS-T洗板5次, 加入anti-CD209抗体(2.5 μg/ml), 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入HRP-羊抗鼠抗体(1:8000), 37℃反应30 min; TBS-T洗板5次, 显色, 用酶标仪测A_{450 nm}。

将自金葡菌的磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和脂多糖(lipopolysaccharides, LPS), 浓度均为20 μg/ml, 4℃反应过夜; TBS-T洗板5次, 5% BSA-TBS-T封闭, 300 μl/孔, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 分别加入sDC-SIGN, 浓度为0、5、10、20 μg/ml, 室温反应2 h; TBS-T洗板5次, 加入anti-CD209, 2.5 μg/ml, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入HRP-羊抗鼠, 1:8000稀释, 37℃反应30 min; TBS-T洗板5次, 显色, 用酶标仪测A_{450 nm}。

细菌常规培养至对数期, 6000 r/min, 10 min, 离心后弃上清, 用PBS洗涤2次, 将细菌调整成为5× 10⁷ CFU/ml, 100 μl/孔室温包被18 h; TBS-T洗板5次, 加入1% BSA的TBS-T封闭, 300 μl/孔, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入10 mM Ca²⁺稀释的sDC-SIGN, 浓度为20 μg/ml, 同时分别加入甘露聚糖100 μg/ml, LAT 20 μg/ml, 1C6 100 μg/ml, 4H3 100 μg/ml, 室温反应2 h; TBS-T洗板5次, 加入anti-CD209 2.5 μg/ml, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入HRP-羊抗鼠, 1:8000稀释, 37℃反应30 min; TBS-T洗板5次, 显色, 用酶标仪测A_{450 nm}。

细菌常规培养至对数期, 6000 r/min, 10 min, 离心后弃上清, 用PBS洗涤2次, 将细菌调整成为5×10⁷ CFU/ml, 100 μl/孔室温包被18 h; TBS-T洗板5次, 加入1% BSA的TBS-T封闭, 300 μl/孔, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 分别加入含有1 mmol/L Ca²⁺、10 mmol/L Ca²⁺稀释的sDC-SIGN, 浓度为20 μg/ml, 和EDTA 10 mmol/L, 室温反应2 h; TBS-T洗板5次, 加入anti-CD209 2.5 μg/ml, 37℃反应1 h; TBS-T洗板5次, 加入HRP-羊抗鼠, 1: 8000稀释, 37℃反应30 min; TBS-T洗板5次, 显色, 用酶标仪测A_{450 nm}值。

应用SPSS 13.0软件进行数据处理, 两组间均数比较采用两独立样本t检验, P < 0.05表示差异有统计学意义。

Western-Blot结果显示, 在非还原和还原条件时都在40 000处有目的条带出现, 并且, 同还原条件相比非还原条件时在高于170 000处还有条带存在(图 1), 这些条带是sDC-SIGN的高聚体形式。结果表明, sDCSIGN蛋白的纯度较高, 可用于后续实验。

图 1(Figure 1)

图 1 Western-blot鉴定sDC-SIGN Figure 1 Identification of sDC-SIGN by Western blotting.1:Protein marker; 2:Unreduced sDC-SIGN; 3:Reduced sDC-SIGN.

图 2(Figure 2)

图 2 sDC-SIGN抑制imDC吞噬金葡菌 Figure 2 sDC-SIGN suppresses phagocytosis of S.aureus by imDC.

imDC能够吞噬金葡菌, 但在加入sDC-SIGN (0.2 μg)后, imDC吞噬金葡菌的能力明显下降。

ELISA结果显示, sDC-SIGN可与金葡菌结合, 且存在浓度依赖关系, 结合能力随着sDC-SIGN的浓度增加而增加(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 ELISA分析sDC-SIGN与金葡菌的结合 Figure 3 Analysis of sDC-SIGN binding to S.aureus by ELISA.

ELISA结果显示, sDC-SIGN可与LTA结合, 并且随着sDC-SIGN浓度增加, 其结合力也随之增强; 但sDC-SIGN不与革兰氏阴性菌LPS结合(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 ELISA分析sDC-SIGN与LTA、LPS的结合 Figure 4 Analysis of sDC-SIGN binding to LTA and LTA by ELISA.*P < 0.05 vs 0 μg/ml sDC-SIGN concentration group.

DC-SIGN的配体甘露聚糖和LTA、抗DC-SIGN抗体1C6和4H3均可有效阻断sDC-SIGN与金葡菌的结合(图 5), 表明sDC-SIGN能特异地与金葡菌表面的糖成分结合。

图 5(Figure 5)

图 5 ELISA分析甘露聚糖、LTA、1C6、4H3对sDC-SIGN结合金葡菌的影响 Figure 5 Effect of mannan, LTA, 1C6 and 4H3 on sDC-SIGN binding to S.aureus.*P < 0.05 vs control group.

sDC-SIGN与金葡菌的结合是Ca²⁺浓度依赖的, Ca²⁺浓度越高结合力越强(P < 0.05, 图 6)。

图 6(Figure 6)

图 6 ELISA分析Ca2+对sDC-SIGN与金葡菌结合的影响 Figure 6 Effect of Ca2+ on sDC-SIGN binding to S.aureus.*P < 0.05 vs control or EDTA group.

近年发现, DC-SIGN还存在另一种形式即sDC-SIGN^[5-6]。然而, 除了Plazolles等^[6]发现sDC-SIGN可促进CMV感染DC和本课题组发现sDC-SIGN可抑制Con A或anti-CD3/CD28活化T细胞的CD69表达、细胞增殖及细胞因子的分泌^[8]外, 未见其它有关sDC-SIGN作用或其生物学意义的报道。

由于DC表面膜型DC-SIGN可识别并结合外源性配体如病原体糖结构而捕获抗原^[12], 因此我们首先测试了sDC-SIGN对imDC吞噬金葡菌的影响, 发现sDC-SIGN能抑制imDC吞噬金葡菌, 然后探索了sDC-SIGN抑制DC吞噬作用的机制。发现sDC-SIGN可结合金葡菌、LTA但对LPS则否。LTA是来自金葡菌的磷壁酸, 而LPS为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分, 则上述结果表明sDC-SIGN可选择性识别并结合金葡菌表面的磷壁酸。发现sDC-SIGN与金葡菌的结合可被DC-SIGN的配体甘露聚糖和LTA、抗人DC-SIGN抗体1C6和4H3有效阻断, 表明sDC-SIGN与金葡菌的结合是特异的。此外, 还发现sDC-SIGN与金葡菌的结合呈Ca²⁺依赖性, Ca²⁺浓度越高二者的结合越强, 进一步证实sDC-SIGN能够与金葡菌表面的糖成分结合。因此, 本实验结果表明, sDC-SIGN可抑制imDC对金葡菌的捕获和吞噬, 其机制是sDC-SIGN优先与金葡菌表面糖成分结合从而抑制了DC膜上DC-SIGN对金葡菌的捕获。

imDC主要负责捕获抗原, 在启动获得性免疫应答中发挥关键作用。膜型DC-SIGN识别并结合外源性配体如病原体糖结构而捕获抗原, 并与T细胞表面ICAM-3相互作用, 参与形成免疫突触, 触发初始T细胞应答^[13-14]。另一方面, 某些慢性感染病原体如HIV、结核杆菌等通过膜型DC-SIGN介导内吞进入DC, 抑制DC功能并利用其作为"特洛伊木马"逃避宿主免疫系统攻击, 而且与易感细胞表面配体如ICAM-3、Lewis糖相互作用, 形成感染性突触而感染新的宿主细胞^[15-16]。我们发现sDC-SIGN对imDC吞噬金葡菌具有抑制作用, 提示sDC-SIGN可能具有免疫调节意义并抑制某些病原体感染宿主细胞。然而, 这种作用的生物学意义和病理学意义尚待进一步研究。