结肠癌是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤，在过去30多年的时间里，结肠癌发病率呈上升趋势。结肠癌多见于中老年人，30~69岁占绝大多数，男性多于女性，发病率占胃肠道肿瘤的第3位，主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。结肠癌的发病与社会环境、生活方式（尤其是饮食习惯、缺乏体力活动）、遗传因素有关。年龄、结直肠息肉史、溃疡性结肠炎及胆囊切除史也是结肠癌的高危因素^[1]。

硫利达嗪（Thioridazine）是哌啶类治疗精神疾病的药物，可以通过靶向大脑中的多巴胺受体，来治疗精神障碍所致焦虑和紧张，广泛应用于精神分裂症、躁狂症的治疗^[2]。据报道，Thioridazine选择性靶向白血病肿瘤干细胞，但对正常造血干细胞没有影响，可能是拮抗白血病肿瘤干细胞的多巴胺受体^[3-4]。PDCD4作为肿瘤抑制和凋亡基因，定位于染色体10q24，PDCD4蛋白由469个氨基酸组成，包含N-末端结构域、C-末端结构域和2个保守的α螺旋MA-3结构域^[5]。PDCD4基因通过调控BCL2和c-MYC介导的PI3K/AKT和JNK/C-Jun途径抑制鼻咽癌细胞增殖^[6]。PDCD4基因参与细胞凋亡调控，发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移作用。然而，PDCD4基因在肿瘤发生中的详细作用机制尚不清楚^[5]。

近年来文献报道Thioridazine对多种肿瘤细胞有杀伤作用^[7-10]，但对结肠癌细胞及PDCD4基因的影响尚未见报道。本研究以SW480细胞作为研究对象，观察Thioridazine对结肠癌细胞凋亡的影响，同时检测BCL2、CCND1、CASPASE3 mRNA及AKT、p-AKT和PDCD4蛋白的变化，进一步阐明其可能的作用机制。

HyClone RPMI 1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自General Electric公司，人抗兔AKT、p-AKT（Ser 473）购自Cell Signaling公司，PDCD4抗体、GAPDH抗体和HRP标记的羊抗兔二抗购自Proteintech公司，细胞周期检测试剂盒和Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自BestBio公司，PrimeScrip^TMRT-PCR和SYBR^® TaqTM II试剂盒购自Takara公司。Thioridazine和其他化学药物购自Sigma公司。

人结肠癌SW480细胞由南方医科大学肿瘤研究所保存。细胞接种于10% FBS的RPMI 1640培养基，5% CO₂、37 ℃适当湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

MTT测定Thioridazine处理后细胞存活率。将SW480细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640培养基，细胞以2.5×10³ cells/well密度接种于96孔培养板。铺板24 h后，不同浓度的Thioridazine（0、5、10、15、20、25和30 μmol/L）加入到各孔中，继续培养24 h。然后取20 μl MTT溶液（Sigma，5 mg/ml）加入到每个孔中。37 ℃培养4 h，小心吸取上清，再加入150 μl DMSO振荡器振荡摇匀10 min，酶标仪490 nm测吸光度A值（A₄₉₀）。计算细胞存活率（%）=（实验组A₄₉₀-空白组A₄₉₀/阴性对照组A₄₉₀-空白组A₄₉₀）×100%，重复3次。

Thioridazine作用24 h后，吸去培养液，用PBS清洗2次，加入40 g/L的多聚甲醛液固定10 min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5 mg/L的Hoechst33342，染色10 min，用PBS清洗3次后，自然干燥，在尼康TE2000倒置荧光显微镜下以340 nm激发光观察细胞凋亡形态并随机拍照。实验重复3次。

消化、离心收集SW480细胞，用冷PBS洗涤细胞2次。用400 μl 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度约为1× 10⁶/ml。在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2~8 ℃避光条件下孵育15 min。加入10 μl PI后轻轻混匀于2~8 ℃避光条件下孵育5 min，流式细胞仪（BD Biosciences公司）分析。

SW480细胞3 × 10⁵/ml密度铺板，Thioridazine（20 μmol/L）处理24 h后，将约1 ×10⁶细胞移入离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清后，用PBS溶液清洗1次，在离心管中留约0.5 ml PBS，加入75%冰乙醇2 ml混匀固定，4 ℃过夜。检测时，离心去乙醇，PBS清洗1次，在离心管中留1 ml PBS，加入Rnase 5 μ（l 10 mg/ml），37 ℃放置30 min，加入PI（100 μg/ml）染液5 μl，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡情况，每个实验重复3次。

使用TRIzol（Invitrogen，Life Technologies，USA）裂解各组细胞，提取总RNA。参照Takara逆转录试剂盒配置20 μl反应液，Biometra梯度PCR仪扩增：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，反转录合成cDNA。采用SYBR^®Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒，Agilent Mx3005PTM（Agilent Technologies，Inc.）荧光定量PCR仪进行扩增，条件为95 ℃、5 s，60 ℃、0.5 min，45个循环（引物序列如表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Sequences of the PCR primers Primer name Primer sequences GAPDH Forward CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA GAPDH Reverse GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC PDCD4 Forward ATGATGTGGAGGAGGTGGATGTG PDCD4 Reverse CCAATGCTAAGGATACTGCCAAC BCL2 Forward GGTGGGGTCATGTGTGTGG BCL2 Reverse CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC c-MYC Forward GGACGACGAGACCTTCATCAA c-MYC Reverse CCAGCTTCTCTGAGACGAGCTT EIF4A Forward ATGGCACTAGGAGACTACATGG EIF4A Reverse CCACGGCTTAACATTTCGTCA PARP1 Forward CGGAGTCTTCGGATAAGCTCT PARP1 Reverse TTTCCATCAAACATGGGCGAC CDK4 Forward TTCGTGAGGTGGCTTTACTG CDK4 Reverse GATATGTCCTTAGGTCCTGGTCT CASPASE3 Forward CATGGAAGCGAATCAATGGACT CASPASE3 Reverse CTGTACCAGACCGAGATGTCA

表 1 引物序列 Table 1 Sequences of the PCR primers

Thioridazine处理SW480细胞24 h后，PBS洗涤2次，加入适量RIPA强裂解液（Leagene Biotech公司）和相关磷酸酶、蛋白酶抑制剂（南京凯基公司），冰浴30 min，刮取总蛋白，4 ℃超声后，12 000 r/min离心15 min取上清，BCA法测定蛋白浓度。10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至PVDF膜，3% BSA封闭，一抗4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次，5 min/次，孵育二抗，洗膜后ECL发光液（Cwbio公司）曝光，ChemiDocTMXRS+成像仪（Bio-Rad公司）检测并保存结果。Image Lab software 3.0.1软件扫描所得条带，计算目的蛋白与GAPDH的灰度比值。

使用SPSS 20.0软件进行统计分析，t检验用于两个独立组的比较，单因素方差分析来确定不同群体之间的统计学意义，P < 0.05为有统计学差异。

Thioridazine（0、5、10、20、25、30 µmol/L）处理SW480细胞24 h后，Thioridazine抑制SW480癌细胞的细胞增殖效果见表 2。随着浓度的不断增加，SW480细胞的存活率明显降低，5 µmol/L浓度时细胞存活率为（81.831±11.427）%，SW480细胞增殖受到抑制。20 µmol/L浓度时细胞存活率为（56.388±10.280）%，与空白对照组[（100.042±3.563）%]相比，具有显著性差异（P < 0.05）。采用20 µmol/L浓度进行后续的试验分析。

表 2(Table 2)

表 2 MTT实验结果 Table 2 MTT assay for evaluating the effect of thioridazine exposure on SW480 cell viability (Mean±SD, n=3) Thioridazine concentration (μmol/L) SW480 cell viability (%) 0 (Control) 100.042±3.563 5 81.831±11.427* 10 71.166±10.529** 15 67.420±3.746** 20 56.388±10.280** 25 45.540±5.140** 30 23.687±1.514** *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

表 2 MTT实验结果 Table 2 MTT assay for evaluating the effect of thioridazine exposure on SW480 cell viability (Mean±SD, n=3)

Thioridazine 20 µmol/L处理24 h后，处理组与对照组相比，细胞收缩变圆，数目明显减少。Hoechst33342细胞核染色结果显示，部分细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征，而对照组细胞核膜完整，核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，细胞核为蓝色均匀淡染，未见凋亡细胞（图 1）。流式细胞仪采用AnnexinV-FITC/PI分析细胞凋亡，如图 2，Thioridazine 20 µmol/L处理24 h后，SW480细胞早期凋亡比例为（3.63±1.38）%，晚期凋亡比例为（21.17±1.93）%，具有明显差异（P < 0.01）。荧光定量结果显示CASASE3 mRNA表达水平降低（图 3），以上结果表明Thioridazine可诱导SW480细胞凋亡。

图 1(Figure 1)

图 1 SW480细胞形态学变化 Figure 1 Morphology of SW480 cells under inverted microscope (Original magnification: ×400). A: Control group; B: Thioridazine (20 μmol/L, 24 h).

图 2(Figure 2)

图 2 Thioridazine 20 µmol/L作用24 h对SW480细胞凋亡率的影响 Figure 2 Apoptotic rate of SW480 cells incubated with 20 μmol/L of thioridazine for 24 h. A: Control group; B: Cells treated with 20 μmol/L thioridazine for 24 h. C: Data statistics of A and B. **P < 0.01 vs control group.

图 3(Figure 3)

图 3 荧光定量PCR检测相关基因mRNA表达情况 Figure 3 Relative mRNA expression detected by fluorescent real-time PCR in SW480 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

Thioridazine可诱导SW480细胞发生G₀/G₁期阻滞（图 4），SW480细胞用Thioridazine处理后G₀/G₁期细胞为（52.893±8.175）%，与对照组的（33.670±2.879）%相比，细胞数目显著升高。荧光定量结果显示CCND1 mRNA表达水平降低（图 3）。这些结果表明，Thioridazine影响DNA复制而导致细胞周期阻滞于G₀/ G₁期，随后诱导细胞凋亡。

图 4(Figure 4)

图 4 20 µmol/L Thioridazine作用24 h对SW480细胞周期的影响 Figure 4 Cell cycle changes of SW480 cells incubated with 20 μmol/L of thioridazine for 24 h. A: Control group; B: Cells treated with 20 μmol/L thioridazine for 24 h; C: Data statistics of A and B. *P < 0.05 vs control group.

PCR结果显示20 µmol/L Thioridazine处理SW480细胞24 h后，PDCD4基因高表达，c-MYC、BCL2、CCND1、CASPASE3、PARP1、CDK4和EIF4A基因表达水平降低（P < 0.05，图 3）。

Thioridazine（20 µmol/L，24 h）处理SW480细胞，PDCD4蛋白明显高表达，AKT蛋白表达没有发生明显变化，但是p-AKT蛋白在给药组表达水平明显降低（P < 0.05，图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 Thioridazine作用后SW480细胞AKT、p-AKT和PDCD4蛋白表达水平变化 Figure 5 Expression AKT, p-AKT and PDCD4 in SW480 cells after thioridazine treatment. A: The bands of Western bloting; B: Ratio of the expression of AKT, p-AKT and PDCD4. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group.

Thioridazine已被报道具有抗增殖活性的肿瘤细胞包括人卵巢癌细胞^[7]、人神经母细胞瘤^[8]、人肝癌HepG2细胞^[9]、人乳腺癌癌细胞^[10-11]、人宫颈癌和子宫内膜癌的细胞^[12]、DLBCL细胞系^[13]、人肾癌Caki细胞^[14]、人胃癌NCI-N87和AGS细胞^[15]等。一系列相关的研究表明，Thioridazine可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥其抗肿瘤的作用。

PI3K/AKT信号通路在人类肿瘤的生理功能中起关键作用，涉及细胞生长、存活到促进血管生成的众多过程^[16-17]。Thioridazine能够抑制PI3K/AKT信号通路^[12]，PDCD4基因位于PI3K/AKT信号通路的下游，因此我们决定研究Thioridazine对SW480细胞PI3K/AKT信号通路及PDCD4的影响。荧光定量与免疫印迹分析表明Thioridazine诱导PDCD4 mRNA、蛋白水平表达升高，抑制AKT蛋白的磷酸化。AKT抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族成员的活化，而抑制AKT磷酸化可直接抑制CASPASE3，从而诱导细胞凋亡。这是首次在结肠癌细胞中证明了Thioridazine能够调控PDCD4基因高表达，是诱导SW480细胞凋亡的通路之一，说明Thioridazine诱导肿瘤细胞凋亡存在新的机制。

Thioridazine通过G₀/G₁期细胞周期阻滞，从而抑制SW480细胞增殖和诱导细胞凋亡。细胞周期蛋白CCND1的水平对细胞周期G₁/S的转换至关重要，GSK3β通过磷酸化作用促进泛素介导的CCND1的降解，抑制AKT磷酸化可以激活GSK3β激酶从而促进CCND1的降解^[18]。在肿瘤细胞中PDCD4诱导p21高表达，导致CDK4降低，我们观察到Thioridazine显著抑制CDK4的表达，从而抑制细胞增殖^[12]。活化的AKT通过磷酸化作用激活下游靶蛋白c-MYC和BCL2，进而调节细胞的增殖。Thioridazine能够抑制p-AKT，导致PI3K/AKT信号通路下游的PDCD4高表达。而PDCD4又能通过抑制c-MYC和BCL2 mRNA的表达，抑制细胞的增殖^[6]，这与荧光定量PCR的分析结果一致。有研究表明，PDCD4可能在转录、翻译和信号转导途径中通过抑制转录阻遏基因EIF4A，从而调节蛋白质的合成，最终抑制了细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡^[19-20]。荧光定量PCR结果显示，Thioridazine处理SW480细胞后，与对照组相比EIF4A mRNA表达水平降低。可见，Thioridazine能够抑制PI3K/AKT信号通路，以及调控下游多个相关基因，细胞周期阻滞在G₀/G₁期，从而抑制SW480细胞增殖，诱导细胞凋亡。

PDCD4在肿瘤中显著下调，与患者不良预后相关。已经有应用Thioridazine成功治疗的宫颈癌患者病例报告^[21]，Thioridazine的抗癌作用通过小鼠模型已经在体内得证实^[22]。本文研究揭示了Thioridazine诱导细胞凋亡一种新机制，鉴于抑制miR-21的表达可使PDCD4表达水平升高^[23]，因此我们猜测Thioridazine抑制SW480细胞生长机制可能与miR-21的表达水平降低相关，这还需要进一步的研究证明。