胃癌预后差的主要原因在于胃癌转移迅速，许多患者在初次就诊时就已存在局部或远处转移，导致手术、化疗等措施无法达到根治。因此寻找胃癌转移相关蛋白质有重要意义。当前蛋白质组学研究已成为研究肿瘤转移的新技术，并已取得一些重要成果^[1-2]。我们前期发现锌指蛋白139（zinc finger protein 139, ZNF139）在胃癌中过表达，与胃癌多药耐药（multidrug resistance, MDR）关系密切^[3-4]，且有促进胃癌侵袭转移的作用^[5-6]，但ZNF139在体内能通过调控哪些蛋白质促进淋巴结转移相关报道很少。故本研究应用蛋白质组学技术对ZNF139调控的胃癌转移相关蛋白质的进行了鉴定，并对这些蛋白质的功能进行了初步分析。

人胃癌细胞株SGC7901（本院科研中心保种并传代）；4周龄BALB/c雄性裸鼠（北京华阜康公司）53只，3~4周龄，体质量20~23 g，其中8只用于皮下移植瘤并传代，45只用于原位移植；RPMI-1640（美国Solarbio公司）；3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]（CHAPS）（美国Aresco）；Trizol Reagent、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、十二烷基硫酸钠（SDS）、甲叉丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、丙烯酰胺（Acrylamide）、四甲基二乙胺（TEMED）、过硫酸氨（AP）均购自美国Sigma；二硫苏糖醇（DTT）（北京华美生物公司）；CyDye荧光染料（Cy3、Cy5）（美国GE Healthcare）；两性电解质（IPG buffer）（美国GE Healthcare）。兔抗人单克隆抗体Fascin、兔抗人多克隆抗体ZNFl39、hnRNPA2/B1、ANXA1、内参照β-actin购自英国Abcam；兔抗人多克隆抗体ANXA5（美国Abgent）。

ABI Prism 7900型荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；U-2001型紫外可见分光光度计（日本日立公司）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；Ettan IPGphor等电聚焦仪（美国GE Healthcare）；DYCZ-28A型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；Typhoon TRIO Variable Mode Imager（瑞典Amersham Bioscience）；Ettan spot picker（美国GE Healthcare）；Flexi-Dry冷冻干燥机（美国FTS Systems）；液质联用仪LTQXL型（美国Thermo）。

胃癌SGC7901细胞复苏后常规培养，于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养于5% CO₂恒温孵育箱中37 ℃下培养传代。

应用上海吉玛制药技术有限公司合成ZNF139-siRNA干扰质粒工程菌（图 1）进行转染实验。菌液接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，使用Tiangen公司质粒中提试剂盒Endofree Maxi Plasmid Kit提取质粒。

图 1(Figure 1)

图 1 ZNF139-siRNA干扰质粒构建 Figure 1 Construction of ZNF139-siRNA plasmid.

ZNF139-siRNA模板序列：5-ACCTCGGAA GATTCAGCAT-3；5-ATGCTGAATCTTCCGAGGT-3。ZNF139-siRNA无关对照模板序列：5-GACGAGTTGAC TGCGATTG-3；5-CAATCGCAGTCAACTCGTC-3。

经定量分析后，分别取2.4、3.6、4.8、6.0 μg重组质粒，用无血清培养基稀释质粒至1 μg/100 μl，加入转染试剂后转染细胞，培养24 h后收集细胞，进行下一步实验。

反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以β-actin为内参照，计算目的基因mRNA相对表达量。反应体系见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 荧光定量RT-PCR反应体系 Table 1 Reaction system of fluorescence quantitative RT-PCR Components Volume Final concentration Forward primer (10μmol/L) 0.5 μl 0.2 μmol/L Reverse primer (10μmol/L) 0.5 μl 0.2 μmol/l 2×Trans startTM top green qPCR super mix 12.5 μl 1× Passive reference dye (5x) 5 μl 1× Template 1 μl ddH2O 5.5 μl Not applicable

表 1 荧光定量RT-PCR反应体系 Table 1 Reaction system of fluorescence quantitative RT-PCR

分别取4.8 μg阳性质粒、阴性质粒转染对数期生长的SGC7901细胞24 h，加入G418（400 μg/ml）筛选，待细胞密度达到80%时用400 μg/ml G418的培养基再筛选1次。直至得到稳定转染细胞株。

45只裸鼠分为ZNF139-siRNA组、阴性质粒组、空白组，每组15只。先建立裸鼠皮下移植瘤模型，鼠间传代5次，以第6代皮下移植瘤为原位移植的瘤源进行胃癌原位移植。具体造模方法依照本课题组前期研究方法进行^[7]。原位移植瘤形成后，每4 d测量一次瘤体长短径，待腹部膨隆，肿瘤长至1.0 cm×1.0 cm左右，出现活动减少，进食减少，体质量下降时，颈椎脱臼处死，取出原位移植瘤，腹腔转移淋巴结至少需要采集5枚以上，标本分为3份，1份福尔马林固定送病理检查，两份迅速放入液氮中保存。

各组织使用超声破碎仪及细胞裂解液进行破碎及裂解，离心取上清并用Tris饱和酚抽提蛋白质，之后用DIGE buffer溶解蛋白质，最后用Bradford法测定蛋白质浓度，-80 ℃保存备用。

取各组蛋白CyDye荧光染料标记各组样品2 h。先后进行一向和二向凝胶电泳，扫描和分析相应图像。在对进行蛋白质点的检测、编辑和匹配、蛋白质点的相对分子质量和等电点校正后，通过DIA和BVA分析选择可重复的点，生成差异蛋白质列表，将差异蛋白质列表导入Ettan spot picker软件分析，并根据结果在凝胶进行挖点。

用NH₄HCO₃和ACN清洗胶粒后冻干，加入含有Trypsin（10 ng/μl）的50 mmol/L NH₄HCO₃（pH 8.0）孵育12 h，吸取上清液并冻干，最后加入15 μl含有0.1% FA的去离子水制备成待测样品。

应用LTQ XL增强型离子阱型质谱仪，通过nanoESI-LC-MS/MS的分析方法鉴定差异表达的蛋白质。二级质谱图谱经BioWorks 3.3.1软件（Thermo Fisher公司）SEQUEST运算方法进行数据库检索。

各组蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电转移至PVDF膜。经5%脱脂奶粉室温封闭90 min，分别加入一抗（1:400），4 ℃孵育过夜。次日，加入二抗，孵育90 min，化学发光法显色。以β-actin为内参照。利用BioRad图像分析系统测定蛋白条带的积分吸光度（L4），以目的蛋白与内参照蛋白L4值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

采用SPSS13.0统计软件对实验结果进行分析，计量资料以均数±标准差表示并应用t检验，以P < 0.05存在差异有统计学意义。

实时定量PCR显示，随质粒浓度增高，转染的SGC7901细胞中ZNF139 mRNA相对表达量逐渐降低（P < 0.05），其中以0.8 μg/μl组抑制效率最高，为82.92%（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 siRNA对ZNF139抑制的荧光定量RT-PCR结果 Figure 2 Effect of siRNA on ZNF139 expression assessed by fluorescence quantitative RT-PCR. *P < 0.05 vs 0 μg/μl group.

原位移植瘤自可触及开始每4 d测量其最长径与最短径，按V=ab²/2（a为长径，b为短径，单位mm）计算移植瘤体积。空白组比阴性质粒组肿瘤无统计学差异（P>0.05）；与阴性对照组比较，实验组原位移植瘤生长明显减慢（P < 0.01，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 原位移植裸鼠肿瘤体积生长曲线 Figure 3 Tumor volume growth curve of the mice bearing orthotopic transplanted tumor.

裸鼠原位成瘤率100%。空白组及阴性质粒组均发现腹腔淋巴结，HE染色证实淋巴结中有癌细胞，淋巴结转移率100%；ZNF139-siRNA组9只裸鼠发现腹腔淋巴结HE染色证实有癌细胞，淋巴结转移率为60%，明显低于空白组及阴性组（χ²=12.857, P < 0.001）。

ZNF139-siRNA组与阴性质粒组的2D-DIGE中，原位移植瘤平均为7658±47个蛋白质点，匹配率为91.6%；转移淋巴结蛋白质点平均为3117±82，匹配率为92.5%。应用DeCyder Differential Analysis Software选取原位移植瘤6个差异蛋白点，LC-MS鉴定出5种蛋白质，经生物信息学分析确定3种可能与肿瘤有关的蛋白质，其中Fascin、hnRNPA2/B1在ZNF139-siRNA组表达下调，ANXA1表达上调。转移淋巴结选取3个差异蛋白点，经LC-MS鉴定出3种蛋白质，经分析确定1种可能与胃癌有关的蛋白质ANXA5，在ZNF139-siRNA组的淋巴结中表达下调（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 ZNF139-siRNA组与阴性质粒组原位移植肿瘤原发灶和转移淋巴结的2D-DIGE结果 Figure 4 Results of 2D-DIGE of the primary tumors (A) and metastatic lymph nodes (B) in ZNF139-siRNA group and negative plasmid group. A: 2D-DIGE figure of ptimary tumors; B: 2D-DIGE figure of metastatic lymph nodes.

Western blot表明，Fascin、hnRNPA2/B1在ZNF139-siRNA组表达下调、ANXA1表达上调（P < 0.01）。ANXA5，在ZNF139-siRNA组的淋巴结中表达下调。结果与蛋白质组学结果一致（图 5、6）。

图 5(Figure 5)

图 5 ZNF139-siRNA组与阴性质粒组原位移植肿瘤原发灶差异蛋白质的Western blot验证结果 Figure 5 Western blotting for verification of the differential proteins in primary tumors in ZNF139-siRNA group and negative plasmid group. *P < 0.05 vs negative control group.

图 6(Figure 6)

图 6 ZNF139-siRNA组与阴性质粒组原位移植肿瘤淋巴结转移灶的Western blot验证结果 Figure 6 Western blotting for verification of the differential proteins in metastatic lymph nodes in ZNF139-siRNA group and negative plasmid group. *P < 0.05 vs negative control group.

本课题组前期研究发现胃癌细胞中锌指蛋白139（zinc finger protein 139, ZNF139）存在过表达^[8]，进一步体外实验发现ZNF139可导致胃癌细胞多药耐药（multidrug resistance, MDR）^[3-4]，还发现ZNF139具有促进胃癌细胞株侵袭迁移能力的作用^[5]。但ZNF139在体内能否促进胃癌细胞侵袭迁移还不明确，故本研究进行了相关体内实验。

我们的前期成功制备了原位移植裸鼠的胃癌转移模型^[7]，本研究以不同处理的胃癌细胞株SGC7901进行原位移植后，结果发现转染了ZNF139-siRNA阳性质粒的胃癌细胞成瘤小、生长慢，且淋巴结转移率低，说明ZNF139具有促进胃癌细胞生长、转移的功能，以ZNF139为靶标采取针对性措施可能抑制胃癌转移。

为了解ZNF139在胃癌转移中直接调节的蛋白质，本研究进一步应用蛋白质组学技术对ZNF139转染前后的差异蛋白质进行了筛选鉴定，结果确定原发灶ZNF139调控的差异蛋白质为Fascin、ANXA1、hnRN-PA2/B1，转移淋巴结中差异蛋白质为ANXA5。研究发现STAT3-NF-κB-Fascin通路在胃癌细胞的侵袭迁移中发挥重要作用^[9]。本研究发现经siRNA抑制ZNF139后Fascin蛋白下降，提示ZNF139可能通过促进Fascin表达促进胃癌转移。hnRNPs与肿瘤关系密切，在胃癌，肺癌，胰腺癌等肿瘤内高表达^[10]，本研究发现抑制ZNF139后hnRNPA2/B1蛋白质表达下调，提示ZNF139可能通过促进hnRNPA2/B1的表达促进胃癌转移。有报道ANXA1在胃癌转移过程中表达下降，为胃癌转移进展的负性标志物^[11]。本研究抑制ZNF139后ANXA1蛋白质表达上调，提示胃癌细胞中的ZNF139可能通过抑制ANXA1而促进胃癌转移。研究发现ANXA5在胃癌中表达增高，与胃癌耐药有关^[12]。本实验抑制ZNF139后转移淋巴结中ANXA5蛋白质表达下调，提示ZNF139可能通过上调ANXA5的表达促进胃癌淋巴结的转移。