乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害着女性的健康，其中三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)具有发病年龄轻、易复发、易转移、预后差等病理及临床特征而引起了越来越多的关注。三阴性乳腺癌系指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体(Her-2)表达均为阴性的乳腺癌^[1]。热休克蛋白90 (heat shock protein 90, Hsp90)作为分子伴侣蛋白调节众多信号蛋白的构象成熟和稳定性，在细胞生长、分化、凋亡以及肿瘤的发展中发挥着重要作用，逐渐成为了目前抗肿瘤药物研究中重要的靶点之一^[2-3]。槚如酸具有水杨酸母核结构，广泛存在于漆树科植物，特别是槚如树(Anacardium occidentale)的果实和银杏(Ginkgo biloba)的叶中，具有抗肿瘤、抗菌、基因表达调节、杀虫等广泛的生物活性^[4]。研究表明，槚如酸虽然对多种肿瘤细胞具有良好的体外、体内的抗肿瘤作用，但其抗肿瘤作用机制的报道较少^[5-7]。本研究以不同浓度的槚如酸作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，探讨槚如酸对Hsp90活性，肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移的影响，为今后的持续研究提供实验理论依据。

克隆酵母Hsp90全基因，在pET-28a高效表达质粒中IPTG (Isopropyl-β-Dthiogalacto-pyranoside)诱导表达，得到Hsp90-tis融合蛋白。再经6x Histidine sepharose CL-6B亲和层析柱进行纯化，可得到纯度90%以上的Hsp90-his融合蛋白^[8]。

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，购于中科院上海细胞库。MDA-MB-231细胞复苏后，于DMEM培养液(含10%胎牛血清，3.7 g/L碳酸氢钠，1×10⁵ IU/L青霉素，100 mg/L链霉素)，置37 ℃、饱和湿度、5% CO₂培养箱中培养，0.25%胰酶消化后传代培养。

DMEM培养液、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：浙江四季青公司；二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司；Transwell小室：Corning公司；Matrigel基质蛋白：BD公司；兔抗人MMP-9，兔抗人TIMP-1：武汉博士德生物工程公司；鼠抗人β-actin、鼠抗人Hsp70：Santacruz公司；山羊抗人Hsp90α：Stressgen公司；Anacardic acid：Santacruz公司(sc-202463)。

Hsp90的ATPase活性检测采用malachite green-molybdat显色反应。将高纯度的Hsp90-his融合蛋白2 μmol/L置于96孔板中，每个孔加入不同浓度的槚如酸和反应缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L KCl，6 mmol/L MgCl₂，pH 7.4)混匀后置37 ℃反应2.5 h，每个药物浓度设三个复孔。反应结束后加入80 μl malachite greenmolybdate溶液显色，并在波长620 nm测每个孔的吸光度(A)值，并计算出槚如酸对Hsp90的ATPase抑制活性。以上实验重复3次^[8]。

向含有Hsp90α蛋白1 μg的反应缓冲液100 μl中各加入不同浓度的槚如酸(0，20，200，2000 nmol/L)，并置于冰中反应。反应30 min后，各反应液加入C10-偶联氨基苯ATP-琼脂糖凝胶50 μl，混匀后置4 ℃继续反应3 h。孵育后，对ATP-琼脂糖凝胶株进行依次洗脱，各洗脱液再经免疫印迹法分析不同浓度药物处理组的Hsp90抗体表达^[8]。

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μl培养液中含有5000个细胞，于5% CO₂饱和湿度37 ℃培养箱中培养。培养24 h后，按不同浓度处理槚如酸，同时设阳性对照组和空白对照组，每个处理3个复孔，继续培养48 h后每孔加入10 μl浓度为5 g/l的MTT溶液继续孵育4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 150 μl，37 ℃孵育30 min，微量振荡器振荡10 min使结晶物充分溶解，用酶标仪在570 nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率/%=实验组A570 nm/对照组A570 nm×100%，绘制剂量效应曲线，采用Logit法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。以上实验重复3次。

取对数生长期MDAMB-231细胞，消化离心，用不同浓度槚如酸的无血清培养基稀释细胞至5×10⁵/ml，每个Transwell小室中加入100 μl，下室每孔加入含5%胎牛血清的DMEM高糖培养基600 μl，培养24 h后取出小室，用棉签擦去小室上层未迁移的细胞，4%多聚甲醛室温固定15 min，0.1%结晶紫染色15 min，各取5个400×视野显微镜下观察拍照。迁移抑制率/%=(1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数) ×100%。

每个Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜铺50 μl Matrigel基质蛋白，用不同浓度槚如酸处理36 h，其余操作同细胞迁移实验。侵袭抑制率/%=(1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数) ×100%。

调细胞浓度为2×10⁵/ml接种于6孔板，2 ml/孔，24 h后开始给药。冰PBS清洗后，滤纸吸干液体后加入细胞裂解液，200 μl /孔，置冰上30 min，细胞刮下，转移至EP管内80 ℃冻存，经3次反复冻融后BCA法定量，调蛋白浓度后加上样缓冲液煮沸10 min。SDS-PAGE后转移至PVDF膜，封闭过夜后，置相关蛋白的一抗、二抗，显色分析。

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析，各组间比较用双侧Dunnett t检验。当P < 0.05时，差异有统计学意义。

本研究通过筛选Hsp90 ATPase活性的体外酶反应方法，发现水杨酸类化合物槚如酸具有特异性地抑制酵母Hsp90重组蛋白的ATPase活性作用。槚如酸抑制Hsp90 ATPase活性的IC₅₀值为82.5 μmol/L，而最典型的Hsp90抑制剂格尔德霉素(GA)的IC₅₀值为3.1 μmol/L (表 1)。另外，ATP-琼脂糖凝胶与Hsp90α结合能力实验验证了槚如酸是通过和ATP竞争性地，与Hsp90蛋白的N-末端ATP结合域结合，而显示出抑制Hsp90 ATPase活性。图 1显示，槚如酸阻碍Hsp90α蛋白与ATP-琼脂糖凝胶株结合，其结合抑制能力呈现出浓度依赖性，并且不同浓度槚如酸与DMSO给药组比较具有显著的抑制效果。

图 1(Figure 1)

图 1 槚如酸的竞争性地结合能力 Figure 1 Competitive binding assay for anacardic acid

表 1(Table 1)

表 1 格尔德霉素和槚如酸生物活性的比较 Table 1 Comparison of biological activities of geldanamcyin and anacardic acid (Mean±SD, μmol/L) Yeast Hsp90 ATPase inhibition assay (IC50) Cell viability assay (IC50) MDA-MB-231 Geldanamycin 3.1±0.2 0.31±0.02 Anacardic acid 82.5±2.6 29.3±0.6

表 1 格尔德霉素和槚如酸生物活性的比较 Table 1 Comparison of biological activities of geldanamcyin and anacardic acid (Mean±SD, μmol/L)

MTT法测定结果显示，与对照组相比，不同浓度的槚如酸(0，12.5，25，50，75，100 μmol/L)处理乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h后均有显著的细胞增殖抑制作用。MDA-MB-231细胞增殖随着槚如酸药物的浓度增加，其抑制作用越明显，IC₅₀值为29.3 μmol/L，且呈现浓度依赖性关系(表 1)。

通过体外Transwell小室法研究发现，不同浓度的槚如酸处理乳腺癌MDA-MB-231细胞36 h后，其MDA-MB-231细胞侵袭能力明显减弱。与对照组相比，给药组(12.5，25，50 μmol/L)的侵袭抑制率分别为：23.6%、56.6%、67.0% (P < 0.05，图 2)。槚如酸具有明显降低MDA-MB-231细胞的侵袭能力，并呈现出一定的浓度依赖性。此外，体外Transwell迁移实验研究发现，槚如酸处理乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，与对照组相比，给药组(12.5，25，50 μmol/L)的迁移抑制率分别为：30.0%、45.5%、77.5% (P < 0.05，图 3)。

图 2(Figure 2)

图 2 槚如酸对MDA-MB-231细胞侵袭能力的抑制 Figure 2 Anacardic acid suppressed the invasion of MDA-MB-231 cells (Original magnification: ×400). A: 0 μmol/L; B: 12.5 μmol/L; C: 25 μmol/L; D: 50 μmol/L; E: Quantitative analysis of MDA-MB-231 cell invasion after anacardic acid treatment. *P < 0.05 vs control.

图 3(Figure 3)

图 3 槚如酸对MDA-MB-231细胞迁移能力的抑制 Figure 3 Anacardic acid suppressed the migration of MDA-MB-231 cells (Original magnification: ×400). A: 0 μmol/L; B: 12.5 μmol/L; C: 25 μmol/L; D: 50 μmol/L; E: Quantitative analysis of MDA-MB-231 cell migration after anacardic acid treatment. *P < 0.05 vs control.

不同浓度的槚如酸(0，25，50，100 μmol/L)处理乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，通过免疫印迹法观察了相关蛋白MMP-9、TIMP-1、Hsp90、Hsp70的表达情况。如图 4所示，Hsp90顾客蛋白之一，MMP-9随着药物浓度的增加，其表达依次下调，呈现出一定的浓度依赖关系。与对照组相比，给药组(25，50，100 μmol/L)的表达下调率分别为：3%、27%、36%(P < 0.05)。而TIMP-1表达随着药物浓度的增加，其表达逐渐上调，呈现出一定的浓度依赖关系。与对照组相比，给药组(25，50，100 μmol/L)的表达下调率分别为：8%、44%、45% (P < 0.05，图 4)。槚如酸作为一个小分子的Hsp90抑制剂，虽然具有显著的抑制Hsp90 ATPase活性，但对Hsp90和Hsp70表达均不产生明显的影响(图 5)。

图 4(Figure 4)

图 4 槚如酸对MMP-9和TIMP-1蛋白表达的影响 Figure 4 Effects of anacardic acid on expression of MMP-9 and TIMP-1. A: Expression of MMP-9 and TIMP-1 proteins detected by Western blotting; B, C: Quantitative analysis of MMP-9 and TIMP-1 expressions in MDA-MB-231 cells. *P < 0.05 vs control.

图 5(Figure 5)

图 5 槚如酸对Hsp90和Hsp70蛋白表达的影响 Figure 5 Effects of anacardic acid on expression of Hsp90 and Hsp70. A: Expression of Hsp90 and Hsp70 proteins detected by Western blotting. B, C: Quantitative analysis of the results of Western blotting.

Hsp90在肿瘤发生、发展的众多信号通路中起作用：包括生长与生长抑制的调控；逃避凋亡；无限制地复制；肿瘤转移和组织浸润；维持血管生成等。TNBC患者约占乳腺癌患者的15%，具有易复发、易转移等特征，并对抗Her-2的靶向药物赫赛汀及内分泌药物治疗均不敏感，目前缺乏对TNBC的规范化药物治疗指南。Hsp90在肿瘤细胞中表达比正常细胞高出2~10倍，因此Hsp90抑制剂对肿瘤细胞具有特定的选择性抗肿瘤作用^[9]。最近研究表明，Hsp90抑制剂如PF-4942847、PU-71在体外体内均显示良好的抗TNBC作用，并且Ganetespib (STA-9090)已处于治疗TNBC的临床II期试验。这些研究提示Hsp90抑制剂用于治疗TNBC具有良好的应用前景^[10-12]。

天然产物一直是新药研发中，发现先导化合物的重要来源之一。本研究通过对实验室拥有的天然化合物进行体外抑制Hsp90 ATPase活性筛选，发现槚如酸具有特异性抑制Hsp90 ATPase活性作用。槚如酸结构上属于水杨酸类衍生物，是典型的histone acetyltransferase抑制剂，并通过抗生长、诱导凋亡等产生抗肿瘤作用^[13]。本实验结果显示，槚如酸具有抑制Hsp90 ATPase活性、抑制肿瘤细胞增殖以及侵袭转移的能力。该研究结果对寻找TNBC治疗药物过程中，发现先导化合物具有重要的指导意义。

Hsp90蛋白N-末端有一个高度保守的ATP结合位点，Hsp90发挥分子伴侣功能的作用机制包括ATP结合到N-末端结构域及随后的ATP水解。大多数Hsp90抑制剂，如GA是通过和ATP竞争性地与N-末端结合，继而通过泛素化蛋白酶体途径降解众多肿瘤相关顾客蛋白。本研究采用了2种体外方法来检测槚如酸的抑制Hsp90活性，结果证明槚如酸对酵母Hsp90 ATPase活性具有特异性的抑制作用，且可能是槚如酸与ATP竞争性地结合于Hsp90的N-末端ATP结合位点。图 1显示随着槚如酸浓度的增加，与ATP-琼脂糖凝胶结合的Hsp90α的量明显下降，即说明槚如酸阻碍Hsp90与ATP的结合。

乳腺癌是全身性恶性肿瘤，转移是乳腺癌患者死亡的重要原因，而细胞外基质(ECM)和基底膜的降解是癌细胞侵袭转移过程中的一个关键步骤。本实验通过Transwell体外侵袭迁移模型模拟在体TNBC肿瘤细胞的侵袭迁移过程，结果显示Hsp90抑制剂槚如酸可有效地抑制MDA-MB-231细胞的侵袭迁移能力，随着药物浓度的增加其抑制效果越明显，即槚如酸对肿瘤细胞的抑制作用呈现剂量-效应关系。据报道，乳腺癌单克隆抗体4C5通过抑制Hsp90与MMP2、MMP9相互作用显著地抑制乳腺癌的骨转移^[14]。Hsp90顾客蛋白之一的MMP9是MMPs中的相对分子质量最大的，参与ECM的IV型、V型胶原和明胶的降解，在肿瘤的血管形成、浸润和转移过程中扮演关键角色^[15]。乳腺癌的转移是多步骤多因素参与的复杂过程，本研究结果显示，在这过程中MMP-9和TIMP-1发挥着重要作用。槚如酸对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力具有显著的抑制作用，其可能机制是通过抑制Hsp90的分子伴侣功能下调MMP-9蛋白表达，同时增加肿瘤细胞自身可产生的TIMP-1的表达增加相关。有趣的是在整个过程中槚如酸对细胞内Hsp90和Hsp70蛋白表达均没有影响，即槚如酸只是抑制Hsp90 ATPase活性，对其蛋白表达均不起作用，与以往的文献报道大致吻合。

综上所述，槚如酸作为一个小分子的新型Hsp90抑制剂，具有较强的体外抗TNBC作用，即抑制Hsp90 ATPase活性，抑制肿瘤增殖、侵袭、迁移。遗憾的是本研究中仅采用了体外检测方法来探讨了槚如酸的抗TNBC作用，因此进一步的体内外药效及其作用机制研究有待于深入。